專利名稱：保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測白藜蘆醇含量的方法，特別是涉及應用液相色譜-質譜儀檢測保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的方法。
背景技術：
白藜蘆醇(英文名稱為Resveratrol)化學名:(E)_5-[2-(4_輕苯基)-乙烯基]-1, 3-苯二酌.;3,5,4，’ -三輕基苗;苗三酌.;Trans-3_4’ -trihydroxystiIbene ;分子式:C14H1203 ;分子量:228.25。物理性質:無味、白色晶體粉末；難溶于水，易溶于乙醇，丙酮等有機溶劑。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結和血管舒張，保持血液暢通，可預防癌癥的發生及發展，具有抗動脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用。抑制腫瘤的作用還具有雌激素樣作用，可用于治療乳腺癌等疾病。延緩衰老、調節血脂、保護心腦血管、抗腫瘤活性、抗菌抗病毒、抗肝炎、白藜蘆醇通過抑制血小板凝集和降低血脂的雙重作用預防心血管疾病；減少心肌損傷和慢性缺血。具有降低血清膽固醇和甘油三酯在肝臟中沉積的功能；明顯提高血清中高密度脂蛋白水平和抑制低密度脂蛋白氧化的作用。對PRL腺瘤有治療和預防雙重作用，在T細胞白血病藥物治療中也具有潛在應用價值。植物來源:白藜蘆醇是蒽醌萜類化合物，現階段市場主要來源之一為于寥科植物虎杖的根莖提取物。虎杖:多年生灌木狀草本，高達I米以上。根莖橫臥地下，木質黃褐色，節明顯。莖直立，圓柱形，表面無毛，散生著多數紅色斑點，中空。單葉互生，闊卵形至近圓形,長7-12cm,寬5-9cm,先端短尖,基部圓形或楔形；葉柄長1_1.5cm托鞘膜質,褐色,早落。花期7-9月，果期9-10月，春秋均可采挖，切斷，曬干。多生于山谷、溪旁或岸邊。分布去國中部及南部，產于江蘇、浙江、江西、福建、山東、河南、陜西、四川等地。另一市場主要來源為葡萄穗軸，是葡萄酒廠的下腳料。因其成本極其低廉，且提取物不含有害添加成分，而逐漸為市場所接受。檢測食品和保健品中白藜蘆醇含量現有的方法主要有以下幾種:1、氣相色譜法用乙酸乙酯萃取法對樣品進行預處理，以硅烷化試劑對萃取物進行衍生。用GC進行定性與定量分析。其缺點就是衍生化形成的副產物可能對色譜分離造成較大困難；在衍生化過程中，容易引入雜質或干擾峰，或使樣品損失。2、高效液相色譜法(HPLC法)用乙酸乙酯萃取法對樣品進行預處理，但無需衍生化，相對步驟繁瑣，且白藜蘆醇的異構化會導致測定失真。失真原因是實驗中發現，隨著對照品在紫外光下的照射，反式白藜蘆醇的色譜峰面積逐漸降低，而順式白藜蘆醇的色譜峰面積逐漸增大
發明內容
本發明的目的是為了解決現有技術中存在的測定步驟繁瑣、耗時長且白藜蘆醇在紫外線照射下的異構化會導致測定結果失真的不足，提供一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法。本發明的技術方案概述如下:一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法，包括如下步驟:(I)稱取待測樣品0.1-0.5g于錐形瓶中，加入40_60mL甲醇,于超聲波水浴中處理20min,靜置冷卻至室溫,在5000r/min離心5分鐘,用快速定性濾紙過濾,濾液用甲醇定容至 IOOmL ；(2)取步驟(I)所獲得的溶液用甲醇稀釋5000倍成待測樣液；(3)將所述待測樣液注入高效液相色譜-質譜儀，用反相C18色譜柱進行色譜分離，質譜儀進行檢測；(4)精確稱取白藜蘆醇標準品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度為標準儲備液；將所述標準儲備液用甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL,
0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL, I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質譜儀，用反相C18色譜柱進行色譜分離，質譜儀進行檢測；得到標準曲線；(5)將步驟(3)獲得的檢驗數據通過標準曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度；所述HPLC條件:流動相及梯度洗脫條件:A:體積百分比為25%的乙腈水溶液，B: IOmM乙酸銨水溶液，等度洗脫；進樣量:IOyL;柱溫:35°C；流速:0.3mL/min ；所述MS/MS條件:電離方式:電噴霧電離，正離子ESr ;毛細管電壓:3.5kV;離子源溫度:110°C;錐孔氣:氮氣，50L/Hr ；脫溶劑氣:氮氣，500L/Hr，溫度400°C ；碰撞氣:IS氣；掃描模式:多反應檢測MRM模式。本發明的有益效果是:HPLC-MS_MS技術靈敏度高，選擇性和特異性好，不僅可對樣品中低濃度的多藥物殘留進行定性確認，克服樣品基質干擾，而且能夠有效排除假陽性，進行功能性食品中殘留物準確的定量分析。本發明的方法準確度好、精度高、線性良好，且便于開展保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定。白藜蘆醇鑒別實驗的方法，因成分含量都很低，部分可能超出氣相色譜和液相色譜儀器的最小檢出限，所以開發高效液相色譜-質譜儀高精密度的方法將能更有效的輔助檢測這些成分。與氣相色譜法相比減少了衍生化的步驟，減少了引入干擾介質的可能；與液相色譜法相比，減少了沸水浴回流提取的步驟，且因高效液相色譜-質譜檢測原理，樣液以及對照品都不會有紫外光的照射，不會發生液相紫外檢測器或二極管陣列檢測器紫外光照射引起的檢測失真。


圖1為實施例1的白藜蘆醇標準品液相色譜質譜圖。圖2為實施例1的樣品液相色譜質譜圖。
具體實施例方式下面通過實例對本發明做進一步的描述，這些描述并不是對本發明內容進一步的限定。本領域的技術人員應理解，對本發明內容所做的等同替換或相應的改進，仍屬于本發明的保護范圍之內。實施例1(I)以葡萄籽提取物為待測樣品，稱取待測樣品0.5g于IOOmL容量瓶中，加入40mL甲醇溶解，于超聲波水浴中處理20min，靜置冷卻至室溫，用離心機5000r/min離心5分鐘，用快速定性濾紙過濾，濾液用甲醇定容至刻度，搖勻；(2)取步驟(I)所獲得的溶液用甲醇稀釋5000倍成待測樣液；(3)將待測樣液注入高效液相色譜-質譜儀，用反相C18色譜柱進行色譜分離，質譜儀進行檢測；(4)精確稱取白藜蘆醇標準品IOmg于IOOmL容量瓶，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度為標準儲備液；將所述標準儲備液用甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL,
0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL, I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質譜儀，用反相C18色譜柱進行色譜分離，質譜儀進行檢測；得到標準曲線；(5)將步驟(3)獲得的檢驗數據通過標準曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度；所述HPLC條件:a)色譜柱:XTerra MS C18,1 SOmmX 2.1mm, 5 μ m ;b)流動相及梯度洗脫條件:A:體積百分比為25%的乙腈水溶液，B =IOmM乙酸銨水溶液，等度洗脫；c)進樣量:IOyL;d)柱溫:35°C ;e)流速:0.3mL/min ；所述MS/MS條件:a)電離方式:電噴霧電離，正離子ESI_。b)毛細管電壓:3.5kV。c)離子源溫度:110°C。d)錐孔氣:氮氣，50L/Hr。e)脫溶劑氣:氮氣，500L/Hr，溫度400°C。f)碰撞氣:IS氣。g)掃描模式:多反應檢測MRM模式。見圖1和圖2 ;其中取184.9m/z子離子用于定量。表I化合物的離子對和電壓
權利要求
1.一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法，其特征是包括如下步驟: (1)稱取待測樣品0.1-0.5g于錐形瓶中，加入40-60mL甲醇，于超聲波水浴中處理.20min,靜置冷卻至室溫,在5000r/min離心5分鐘,用快速定性濾紙過濾,濾液用甲醇定容至 IOOmL ； (2)取步驟(I)所獲得的溶液用甲醇稀釋5000倍成待測樣液； (3)將所述待測樣液注入高效液相色譜-質譜儀，用反相C18色譜柱進行色譜分離，質譜儀進行檢測； (4)精確稱取白藜蘆醇標準品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度，為標準儲備液；將所述標準儲備液用甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL，0.2 μ g/mL,.0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL, I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質譜儀，用反相C18色譜柱進行色譜分離，質譜儀進行檢測；得到標準曲線； (5)將步驟(3)獲得的檢驗數據通過標準曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度； 所述HPLC條件: 流動相及梯度洗脫條件:A:體積百分比為25%的乙腈水溶液，B =IOmM乙酸銨水溶液，等度洗脫； 進樣量:10μL; 柱溫:35°C ；流速:0.3mL/min ； 所述MS/MS條件: 電離方式:電噴霧電離，正離子ESI_ ； 毛細管電壓:3.5kV ； 離子源溫度:110°C ; 錐孔氣:氮氣，50L/Hr ； 脫溶劑氣:氮氣，500L/Hr，溫度400°C ； 碰撞氣:気氣； 掃描模式:多反應檢測MRM模式。
全文摘要
本發明公開了一種保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定方法，步驟稱取待測樣品加入甲醇，于超聲波水浴中處理，靜置冷卻至室溫，離心，過濾，濾液用甲醇定容；用甲醇稀釋成待測樣液；注入高效液相色譜-質譜儀進行檢測；精確稱取白藜蘆醇標準品于容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度，為標準儲備液；用甲醇分別稀釋，配成0.1μg/mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL，0.8μg/mL，1μg/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-質譜儀進行檢測；得到標準曲線；將獲得的檢驗數據通過標準曲線計算待測樣品中白藜蘆醇濃度；本發明的方法準確度好、精度高、線性良好，且便于開展保健品、食品或原料中白藜蘆醇含量的測定。
文檔編號G01N30/88GK103105448SQ20111036157
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者趙曉娟, 李星芝, 孫俊峰 申請人:天津天獅生物發展有限公司, 天獅集團有限公司, 天津天獅生命源有限公司