專利名稱：一種帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶聯蛋白質的方法
技術領域：
本發明屬于醫學免疫學領域，涉及一種基于膠乳增強免疫比濁法檢測試劑的制備方法，特別是涉及一種帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球與蛋白質的共價偶聯的方法。
背景技術：
膠乳增強免疫比濁法由于具有檢測方法簡單方便，線性范圍寬，穩定性好，同時可在全自動生化儀上實現大量樣品檢測等優點，已經越來越多的被應用于臨床檢測項目。膠乳增強免疫比濁法是通過采用物理吸附或共價鍵合的方式將抗體或抗原偶聯到納米微球的表面，形成微球-抗體(抗原)復合物。此復合物與樣品中的抗原(抗體)，通過抗體抗原反應，形成微球-抗體-抗原聚集顆粒，隨著免疫反應的不斷發生，聚集的顆粒不斷增大，從而導致溶液在一定波長(如600nm)的吸光值發生顯著的變化，通過測定免疫反應前后吸光度值的變化可以計算出樣品中抗原(抗體)的濃度，從而達到檢測和診斷疾病的目的。迄今，膠乳增強免疫比濁分析方法在臨床中已經應用于檢測脂蛋白a、抗鏈球菌溶血素“O”、類風濕因子、C-反應蛋白、β 2-微球蛋白、α I-微球蛋白、D- 二聚體、胱抑素C、肌鈣蛋白、肌紅蛋白、CK-MB、甲胎蛋白、糖化血紅蛋白和前列腺特異性抗原等多種檢測項目，診斷領域已涉及腫瘤、風濕、肝功能、腎功能等多個領域，擁有廣闊的應用前景。膠乳增強免疫比濁法一般采用雙試劑，即反應試劑(Rl)和反應試劑(R2)，其中，Rl為帶有一定濃度促凝劑的緩沖溶液，R2為固定化抗體(或抗原)的膠乳微球溶液。R2是膠乳增強免疫比濁法的核心部分，對膠乳增強免疫比濁試劑的檢測靈敏度、線性范圍以及穩定性起決定作用。而在膠乳試劑R2的制備過程中，選擇的膠乳微球以及在微球上固定化抗體(或抗原)的工藝決定了制備的膠乳試劑R2的性能。抗體(或抗原)在本質上都是蛋白質，將蛋白質偶聯到膠乳微球上主要有兩種方式，即物理吸附與化學偶聯。物理吸附的蛋白質在長期儲存過程中易從膠乳微球表面脫落，進而使檢測靈敏度下降；化學偶聯的蛋白質可被穩定固定在膠乳顆粒表面，目前的常規偶聯方法是碳二亞胺法，但是此方法在偶聯過程中易使膠乳微球聚集，不利于后續膠乳微球的處理。此外，在抗體與微球偶聯后，需將殘余抗體與偶聯了抗體的膠乳微球分離，離心是現有報道的工藝中最常用的分離方法(專利，申請號201010192601. 9)。但是離心分離殘余抗體的方法容易導致偶聯抗體的膠乳微球的聚集，需要采用超聲等分散方法將偶聯抗體的膠乳微球重新懸浮分散。而在分散過程中容易導致抗體失活和從膠乳微球上的脫落，并且離心的方法不利于膠乳比濁試劑的放大生產。此外，由于抗體的活性端為Fab片段，在偶聯過程中也可與膠乳微球發生反應，從而無法用于與抗原發生免疫反應，因此使抗體的活性端盡量暴露，提高抗體的利用率，將 對降低生產成本具有重要意義。但是目前常用的膠乳微球和偶聯工藝均不能有效的解決以上問題。針對上述問題，本專利提供了一種化學偶聯蛋白質與膠乳微球的新方法，有效的解決了上述問題。
發明內容

本發明的目的在于提供一種羧化聚苯乙烯微球上化學偶聯抗體的方法。本方法采用具有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球，應用化學法將蛋白質(抗體或抗原)偶聯于微球表面，制備得到膠乳增強免疫檢測試劑。由于采用了具有間隔臂的膠乳微球，微球上的間隔臂對蛋白質起到了一定的支撐作用，從而使其活性位點盡量暴露，提高了抗體的利用率。同時該工藝改進了制備方法，在將偶聯了抗體的膠乳微球與殘余的抗體分離時采用了切向流過濾技術，克服了離心分離工藝中的膠乳微球聚集以及后續的膠乳微球的超聲再分散的問題，從而避免了抗體的脫落和失活。同時更有利于放大生產。采用該工藝制備的檢測試劑具有很好的靈敏度和長期穩定性。本發明是通過下述技術方案加以實現的本發明的羧化聚苯乙烯微球偶聯蛋白質的方法，包括微球的活化，蛋白質的偶聯，切向流過濾分離殘留的抗體與膠乳微球，以及微球的封閉四個步驟。I)微球的活化；采用I-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化羧化聚苯乙烯微球，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基；2)蛋白質的偶聯；3)切向流過濾分離殘留的抗體與膠乳微球；4)以及微球的封閉四個步驟。所述的步驟I)采用如下方法取O. 5-2. 5ml濃度為1% _5%質量分數的具有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球，加去離子水或蒸餾水稀釋到O. 5-2倍后，分別加入20-180 μ I lmg/ml的1_ (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫反應10-40min。所述步驟2)采用如下方法向第一步活化后的微球溶液中加入4mg-20mg的蛋白質溶液，37°C反應1-5小時。所述步驟3)的方法采用截留分子量為300KD或500KD的膜包，20_100mM三羥甲基氨基甲烷或甘氨酸緩沖液作為洗液，切向流過濾除去未與微球偶聯的蛋白質。所述的三羥甲基氨基甲烷或甘氨酸緩沖液作為洗液緩沖液的pH優選為6. 5-8. O。所述步驟4)的方法，采用如下方法收集切向流過濾后的微球溶液，羧化聚苯乙烯微球經上述反應最終通過切向流過濾可收集10-20ml，向此收集液中加入15-30mg的牛血清白蛋白對微球表面沒有偶聯蛋白質的殘留位點進行封閉。具體技術路線如下第一步，微球的活化。采用I-(3-二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)活化羧化聚苯乙烯微球，使其能夠與蛋白質發生偶聯反應(其反應方程式參見圖I)，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基，增加了微球間的靜電排斥，進而避免聚集，保證微球的整體穩定性。具體活化方法如下取O. 5-2. 5ml濃度為1%-5% (質量分數)的羧化聚苯乙烯微球，加一定體積的去離子水或蒸餾水稀釋O. 5-2 倍后，分別加入 20-180 μ I lmg/ml 的 Sulfo-NHS 和 EDC,室溫反應 10_40min。第二步，蛋白質的偶聯，活化后的微球易與蛋白質的N末端反應。具體偶聯方法如下向第一步活化后的微球溶液中加入4mg-20mg的蛋白質溶液，37°C反應1_5小時。其偶聯過程反應參見圖I。其中R-NH2表示與微球偶聯的蛋白質，其N端與活化后的微球反應，進而將蛋白質固定于微球上(R代表除N端外，蛋白質的其它部分)。第三步，切向流過濾，采用截留分子量為300KD或500KD的膜包，20_100mM三羥甲基氨基甲烷(tris)或甘氨酸緩沖液(pH 6. 5-8. O)為洗液，切向流過濾除去未與微球偶聯的蛋白質。第四步微球的封閉，小心收集切向流過濾后的微球溶液，羧化聚苯乙烯微球經上述反應最終通過切向流過濾可收集10-20ml，向此收集液中加入15-30mg的牛血清白蛋白(BSA)對微球表面沒有偶聯蛋白質的殘留位點進行封閉。本發明提供的制備工藝與現有的技術相比，其明顯的優勢在于采用具有間隔臂的膠乳微球，間隔臂的引入對偶聯的蛋白質起到一定的支撐作用，可以大大的提供抗體(或抗原)的利用率，從而降低生產的成本(抗體或抗原的價格較高)；采用切向流過濾技術去除反應后殘余的抗體(或抗原)，使反應液(R2)的制備始終處于溶液狀態，與傳統的高速離心分離方法相比，此分離方法溫和，且不需超聲重新分散，簡化了制備工藝，同時避免了抗體(或抗原)的脫落和失活，很好的克服了傳統分離方法的缺點；本工藝簡化了制備過程，因此工藝相對簡單，所需儀器設備價格便宜，更有利于放大生產；本制備工藝具有一定的通用性，可以適用于多種不同的蛋白質偶聯于微球的反應，更有利于規模化生產。


圖1 :蛋白質與羧化聚苯乙烯微球化學偶聯反應方程式；圖2 :膠乳增強免疫比濁發測定B2M的標準曲線對比圖。
具體實施例方式實施例I :偶聯β 2微球蛋白(Β2Μ)抗體取O. 5ml (O. 5-2. 5ml), 5% (1% -5% )，124nm的帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球加 Iml (O. 5-2 倍)去離子水稀釋，分別加入 20 μ I (20-180 μ I) lmg/ml 的 suIfo-NHS 和 EDC.HC1，室溫反應lOmin。反應完后，加入320μ I 37. 5mg/ml (共12mg，4_20mg)的B2M抗體(伊普西隆生物科技有限公司(浙江、瑞安))，37度反應I小時。用截留分子量500kD的膜包進行切向流過濾，分離殘留抗體與膠乳微球，洗液為20mM Tris, pH = 6. 5，無抗體濾出后，收集IOml (10-20)膠乳微球溶液，加入30mg(15-30mg)BSA 37攝氏度封閉3小時，制得固定有B2M抗體的膠乳微球。制備的微球用O. 2M，pH7. 4Tris_HCl緩沖液配制成O. I %的溶液作為 R2，選用含 1% PEG8000,0. 3M NaCl 的 O. 2M，pH7. 4Tris_HCl 緩沖液作為 R1，對 B2M 進行檢測，結果參見圖2。由圖可知，樣品中B2M為0-20mg/L的范圍該檢測試劑具有較好的線性，說明即便是B2M為20mg/L時，微球上的抗體量仍可保證過量，進而保持良好的線性。為進一步說明帶有間隔臂微球的優勢，采用同樣的偶聯抗體條件，在沒有間隔臂的微球上進行偶聯抗體，制備B2M膠乳微球檢測試劑，采用該膠乳微球進行B2M檢測，將其檢測結果與采用本專利的方法制備的膠乳增強免疫檢測試劑(即采用帶有間隔臂的膠乳微球)的檢測結果進行對比，其對比結果見圖2。由圖可知B2M在0-10mg/L的范圍內具有較好的檢測線性，當B2M為20mg/L時，檢測值明顯下降，說明微球表面的有效抗體的量不足與抗原B2M反應。對比圖2中帶有間隔臂的微球與沒有間隔臂的微球制備的B2M檢測試劑的檢測線性范圍對比說明帶有間隔臂的微球可以有效提高抗體的活性，進而提高固定化效率，具有顯著的優越性。實施例2 :偶聯C-反應蛋白(CRP)抗體取I. 5ml (O. 5-2. 5ml) ,1% (1% ~5% )，124nm的帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球加 O. 75ml (O. 5-2 倍)去離子水稀釋，分別加入 100 μ I lmg/ml (20-180 μ I)的 sulfo-NHS和 EDC.HC1，室溫反應 30min。反應完后，加入 150μ1 37. 5mg/ml (共 4mg，4_20mg)的 CRP抗體(伊普西隆生物科技有限公司(浙江、瑞安))，37度反應3小時。用截留分子量300kD的膜包進行切向流過濾，分離殘留抗體與膠乳微球，洗液為50mM Tris,pH = 7. 2，無抗體濾出后，收集15ml(10-20ml)膠乳微球溶液，加入15mg(15-30mg)BSA 37攝氏度封閉24小時，制得固定有CRP抗體的膠乳微球。實施例3 :偶聯人血清白蛋白(HSA) 取2. 5ml (O. 5-2. 5ml), 2. 5% (1% -5% )，124nm的帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球加Iml去離子水稀釋，分別加入180 μ I (20-180 μ I) lmg/ml的suIfo-NHS和EDC. HCl，室溫反應5小時。反應完后，加入800μ1 25mg/m(20mg，4-20mg)l的HSA(伊普西隆生物科技有限公司(浙江、瑞安))，37度反應5小時。用截留分子量300kD的膜包進行切向流過濾，分離殘留抗體與膠乳微球，洗液為IOOmM Tris, pH = 8. O,無蛋白質濾出后，收集20ml (10-20ml)膠乳微球溶液，加入20mg (15-30mg) BSA 37攝氏度封閉10小時，制得固定有HSA的膠乳微球。
權利要求
1.一種帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶聯蛋白質的方法，其特征是步驟如下 1)微球的活化；采用I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化羧化聚苯乙烯微球，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基； 2)蛋白質的偶聯； 3)切向流過濾分離殘留的抗體與膠乳微球； 4)以及微球的封閉四個步驟。
2.如權利要求I所述的方法，其特征是所 述的步驟I)采用如下方法 取O. 5-2. 5ml濃度為1% _5%質量分數的羧化聚苯乙烯微球，加去離子水或蒸餾水稀釋到O. 5-2倍后，分別加入20-180 μ I lmg/ml的1_ (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫反應10_40min。
3.如權利要求I所述的方法，其特征是步驟2)采用如下方法 向第一步活化后的微球溶液中加入4mg-20mg的蛋白質溶液，37°C反應1_5小時。
4.如權利要求I所述的方法，其特征是步驟3)采用如下方法 采用截留分子量為300KD或500KD的膜包，20_100mM三羥甲基氨基甲烷或甘氨酸緩沖液為洗液，切向流過濾除去未與微球偶聯的蛋白質。
5.如權利要求4所述的方法，其特征是所述的緩沖液的pH為6.5-8. O。
6.如權利要求I所述的方法，其特征是步驟4)采用如下方法 收集切向流過濾后的微球溶液，羧化聚苯乙烯微球經上述反應最終通過切向流過濾可收集10-20ml，向此收集液中加入15-30mg的牛血清白蛋白對微球表面沒有偶聯蛋白質的殘留位點進行封閉。
全文摘要
本發明涉及一種帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶聯蛋白質的方法，包括1)微球的活化采用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺活化羧化聚苯乙烯微球，活化后的聚苯乙烯微球表面引入了磺酸基；2)蛋白質的偶聯；3)切向流過濾分離殘留的抗體；4)以及微球的封閉四個步驟。本方法采用具有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球，應用化學法將蛋白質(抗體或抗原)偶聯于微球表面，從而使其活性位點盡量暴露，提高了抗體的利用率，從而降低了生產成本。將偶聯了抗體的膠乳微球與殘余的抗體分離時采用了切向流過濾技術，克服了離心分離工藝中抗體易脫落和失活的缺點。同時本發明具有一定的通用性，更有利于工業生產的規模化和放大化。
文檔編號G01N33/531GK102621296SQ20121000552
公開日2012年8月1日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者徐亮, 王冬梅 申請人:天津醫科大學