專利名稱：定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒。
背景技術(shù)：
腎素(renin)是腎小球旁器、球旁細胞釋放的一種蛋白水解酶。腎素經(jīng)腎靜脈進入血液，能催化血漿中的血管緊張素原(在α 2球蛋白中)轉(zhuǎn)變成血管緊張素I (10肽)，血液和肺組織中的轉(zhuǎn)換酶使血管緊張素I降解為血管緊張素II (8肽)，后者可被氨基肽酶水解為血管緊張素111(7肽)。這三種血管緊張素均有生物活性，其中血管緊張素II、ΙΙΙ的生物活性較強，而后者在血中的濃度較低，故以血管緊張素II的生物活性最強。血管緊張素原和轉(zhuǎn)換酶等經(jīng)常存在于血漿中，腎素的釋放是決定血漿中血管緊張素濃度的關(guān)鍵性條件。血漿腎素含量的檢測，可用于診斷由于腎動脈狹窄導(dǎo)致的高血壓或腎血管性高血壓，幫助臨床醫(yī)生決定是否進行腎血管的影像學(xué)研究，診斷原發(fā)性醛固酮增多癥，以及為原發(fā)性高血壓病人心血管系統(tǒng)的并發(fā)癥的發(fā)生提供有效的信息等。另外對于指導(dǎo)用藥和治療效果的評價有很重要的意義，例如，對于一些腎上腺功能低下并采用類固醇激素替代治療的病人，當(dāng)治療效果充足時，腎素水平正常，當(dāng)治療效果不足時，腎素水平過高。腎素活性-血管緊張素II-醛固酮，在臨床應(yīng)用中，通常被稱為高血壓三項。目前對于腎素含量的檢測，常通過檢測血漿中血管緊張素I的濃度，來間接衡量腎素含量，稱之為腎素活性。腎素活性的測定是由于血漿樣本內(nèi)的腎素在一定PH值和反應(yīng)時間內(nèi)，將樣本中內(nèi)源性的血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素I，采用競爭法檢測樣本中的血管緊張素I的濃度，根據(jù)單位時間內(nèi)生成血管緊張素I濃度的不同，來計算血漿樣本的腎素活性，腎素活性的這種測定方法對標(biāo)本處理、環(huán)境條件、PH值、時間等都要求極為苛刻，室內(nèi)及室間重復(fù)性差。對于直接測定腎素濃度的方法目前還鮮有報道，特別是采用均相的磁微粒發(fā)光技術(shù)， 國內(nèi)外尚未有該技術(shù)的建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，該試劑盒直接用抗腎素抗體作為包被和標(biāo)記，測定血漿中的腎素含量，實現(xiàn)了腎素含量的直接評價。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括偶聯(lián)有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗腎素單克隆抗體、化學(xué)發(fā)光底物Α、化學(xué)發(fā)光底物B以及洗液。所述磁微粒混懸液中的抗腎素抗體為小鼠抗腎素單克隆抗體，磁微粒為表面含有羧基的活性基團。所述校準(zhǔn)品是以0. 05Μ的Tris_NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白組成PH7. 4的緩沖液為基質(zhì)，加入腎素純品配制而成，校準(zhǔn)品形態(tài)為液態(tài)且具有良好的穩(wěn)定性。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗腎素單克隆抗體為大鼠抗腎素單克隆抗體，該抗腎素單克隆抗體是以0. OlM的PBS和1%酪蛋白作為緩沖液基質(zhì)，工作濃度為1:1000。所述化學(xué)發(fā)光底物A由Luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59 mM、沒食子酸0. 35 mM、 Tris-HCl緩沖液0. 2M組成，最后調(diào)pH7. 4 ；化學(xué)發(fā)光底物B由0. 2M乙酸-乙酸鹽緩沖液、 維生素C 0. 12 mM、氨基酸氧化酶0.85 mM組成，最后調(diào)pH7. 4。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用雙抗體夾心法聯(lián)合磁微粒化學(xué)發(fā)光技術(shù)，直接采用抗腎素抗體作為包被和標(biāo)記，測定血漿中的直接腎素含量，實現(xiàn)了腎素含量的直接評價；本發(fā)明試劑盒實現(xiàn)了操作的簡便性和自動化性，具有檢測時間短、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確、變異性小的特點。


圖1是本發(fā)明試劑盒檢測血漿腎素的校準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括偶聯(lián)有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗腎素單克隆抗體、化學(xué)發(fā)光底物A、化學(xué)發(fā)光底物B以及洗液。偶聯(lián)有抗腎素抗體的磁微粒混懸液中的抗腎素抗體為鼠抗腎素單克隆抗體，磁微粒為表面含有羧基的活性基團；采用雙抗體夾心法，所用的兩株配對抗體均為鼠抗腎素單克隆抗體，因此具有優(yōu)異的特異性；磁微粒混懸液采用氨基戊二醛法制備，通過化學(xué)鍵聯(lián)結(jié)磁性微粒和腎素抗體，腎素抗體的濃度控制在0. 30ug/人份，以0. OlM的PBS和1%BSA作為緩沖體系和保護體系；
所用的校準(zhǔn)品是以0. 05M的Tris-NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白組成 PH7. 4的緩沖液為基質(zhì)，加入腎素純品配制而成，校準(zhǔn)品形態(tài)為液態(tài)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗腎素單克隆抗體為大鼠抗腎素單克隆抗體，用0. OlM的 PH7. 4的PBS和1%酪蛋白組成的稀釋液將其稀釋至工作濃度1 1000。化學(xué)發(fā)光底物A由Luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59 mM、沒食子酸0.35 mM、 Tris-HCl緩沖液0. 2M組成，最后調(diào)pH7. 4 ；化學(xué)發(fā)光底物B由0. 2M乙酸-乙酸鹽緩沖液、 維生素C 0. 12 mM、氨基酸氧化酶0. 85 mM組成，最后調(diào)pH7. 4。洗液由0. IM磷酸鹽緩沖液和l%TWeen20配制而成，使用時用蒸餾水20倍稀釋。本發(fā)明試劑盒使用操作程序如下
1、在反應(yīng)杯中依次加入100μ 1校準(zhǔn)品及待測樣本；
2、在上述反應(yīng)杯中再加入磁微粒混懸液20μ1 ；
3、將反應(yīng)杯中的溶液混合均勻，37°C溫育15分鐘；
4、使用磁分離器洗滌設(shè)備，將反應(yīng)杯中的磁微粒用洗液洗滌3次；
5、在反應(yīng)杯中加入酶標(biāo)記物50μ1，37°C溫育15分鐘；
6、使用磁分離器洗滌設(shè)備，將反應(yīng)杯中的磁微粒用洗液洗滌3次；7、加入發(fā)光底物A和發(fā)光底物B各50μ 1，混勻后室溫避光反應(yīng)5分鐘；
8、使用化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光信號值并記錄；
9、采用四參數(shù)擬合方式，建立定標(biāo)曲線，計算測定結(jié)果。使用本發(fā)明試劑盒按照上述程序檢測血漿腎素濃度，所用時間較短，測定結(jié)果僅需45分鐘即可得出，方便快捷，且準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好。本試劑盒檢測血漿腎素可達到如下指標(biāo)
校準(zhǔn)曲線范圍0pg/ml — 500pg/ml ；
校準(zhǔn)曲線線性濃度值和檢測發(fā)光值以四參數(shù)擬合方式進行線性擬合，線性系數(shù)R > 0. 999，見圖1 ；圖1原始數(shù)據(jù)，用四參數(shù)擬合，X為濃度值，Y為發(fā)光值取log;
權(quán)利要求
1.一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于它包括偶聯(lián)有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗腎素單克隆抗體、化學(xué)發(fā)光底物 A、化學(xué)發(fā)光底物B以及洗液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于 所述磁微粒混懸液中的抗腎素抗體為小鼠抗腎素單克隆抗體，磁微粒為表面含有羧基的活性基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于 所述校準(zhǔn)品是以0. 05M的Tris-NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白組成pH7. 4的緩沖液為基質(zhì)，加入腎素純品配制而成，校準(zhǔn)品形態(tài)為液態(tài)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于 所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗腎素單克隆抗體是大鼠抗腎素單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于 所述化學(xué)發(fā)光底物A由Luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59 mM、沒食子酸0. 35 mM,Tris-HCl 緩沖液0. 2M組成，最后調(diào)pH7. 4 ；化學(xué)發(fā)光底物B由0. 2M乙酸-乙酸鹽緩沖液、維生素C 0. 12 mM、氨基酸氧化酶0. 85 mM組成，最后調(diào)pH7. 4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，包括偶聯(lián)有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗腎素單克隆抗體、化學(xué)發(fā)光底物A、化學(xué)發(fā)光底物B以及洗液。本試劑盒采用均相的磁微粒發(fā)光技術(shù)和抗體夾心法直接測量血漿中的腎素濃度，具有檢測時間短、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確、變異小的特點，本試劑盒替代了腎素活性的檢測，直接測定血漿中腎素的含量，實現(xiàn)了腎素含量的直接評價。
文檔編號G01N33/577GK102565037SQ20121000688
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者付光宇, 劉功成, 吳學(xué)煒, 李文娟, 渠海, 王敏, 秦東春, 趙鵬, 鄭立運, 陸瑩, 陳科, 馬建軍 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司