專利名稱：輔助診斷結核病患者的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種輔助診斷結核病患者的試劑盒。
背景技術：
結核病是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，全球有1/3的人口感染了結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB),每年有200萬人死于結核病,其死亡率在傳染性疾病中僅低于艾滋病排第二。結核病的治療周期很長，一般在6個月以上，而且抗結核化療過程經常出現藥物副作用，使得患者依從性不容樂觀。尤其，治療期間病情進展以及治療后治愈狀態的評估沒有很好的指標。目前臨床常用的細菌學及影像學檢查方法存在很多缺點。細菌學檢查最常見的痰涂片和痰培養敏感性在50%左右，如果患者不排菌或排菌量少，就很難作為可信性指標。而且痰培養一般都在I個月后才能出結果，所以不能及時反映患者病情轉歸狀態。而影像學檢查結果受主觀性因素影響比較大，不同醫生、不同醫院診斷結果差異較大。如果對病情進展的判斷出現偏差，不僅延誤治療，還會增加耐多藥患者出現的可能性。因此，結核病治療急需一種能客觀準確反映結核病轉歸以及治療效果的新型指標。

發明內容
本發明的目的是提供一種輔助診斷結核病患者的試劑盒。本發明提供的輔助診斷結核病患者的試劑盒，包括結核分枝桿菌總蛋白和用于檢測白細胞介素-8的物質。所述結核分枝桿菌總蛋白是將結核分枝桿菌進行總蛋白提取得到的。所述結核分枝桿菌總蛋白可按如下方法制備將結核分枝桿菌破碎菌體并收集上清液，然后用 0. 22 無菌濾器進行過濾，獲得無菌的結核分枝桿菌總蛋白溶液。所述結核分枝桿菌總蛋白具體可按如下方法制備取IOOmL OD600 = I的結核分枝桿菌菌液，4°C、3000g離心IOmin, 收集菌體，洗滌后用ImL 4°C預冷的PBS緩沖液重懸；然后加入0. Imm 二氧化硅珠子，在 FastPr印-24儀器上以6. 5m/s (米/秒)的振蕩速度破碎I分鐘，4°C、IOOOOg離心IOmin, 取上清液；將上清液用0. 22 無菌濾器進行過濾，獲得無菌的結核分枝桿菌總蛋白溶液。所述結核分枝桿菌具體可為H37Rv標準株。所述用于檢測白細胞介素-8的物質為白細胞介素-8的抗體，如單克隆抗體或多克隆抗體，也可直接商購用于檢測白細胞介素-8的試劑盒。所述試劑盒的使用方法如下取ImL待測患者的外周血于細胞培養板，加入IOu L 結核分枝桿囷總蛋白標準液，混勾，在37 C>5% CO2條件下放直24h ;然后將血液樣品全部轉移至新的I. 5mL離心管，室溫下3000rpm離心10分鐘，收集上清液，用PBS緩沖液稀釋至 200倍體積，作為待測溶液，檢測其中的白細胞介素-8含量。所述結核分枝桿菌總蛋白標準液的具體制備方法如下將無菌的結核分枝桿菌總蛋白溶液用無菌PBS緩沖液稀釋至蛋白濃度為lmg/mL,即為結核分枝桿菌總蛋白標準液。
所述輔助診斷結核病患者具體指的是輔助診斷結核病患者是否治愈、輔助診斷待測患者是否為結核病患者或輔助診斷結核病患者的嚴重程度(如細菌載荷量和肺部病理損傷程度)。本發明還保護以上任一所述結核分枝桿菌總蛋白和用于檢測白細胞介素-8的物質在制備輔助診斷結核病患者的試劑盒中的應用。所述結核分枝桿菌具體可為H37Rv標準株。所述用于檢測白細胞介素-8的物質為白細胞介素-8的抗體，如單克隆抗體或多克隆抗體，也可直接商購用于檢測白細胞介素-8的試劑盒。所述輔助診斷結核病患者具體指的是輔助診斷結核病患者是否治愈、輔助診斷待測患者是否為結核病患者或輔助診斷結核病患者的嚴重程度(如細菌載荷量和肺部病理損傷程度)。本發明還保護一種輔助診斷結核病患者的試劑盒，包括結核分枝桿菌和用于檢測白細胞介素-8的物質。所述結核分枝桿菌具體可為H37Rv標準株。所述用于檢測白細胞介素-8的物質為白細胞介素-8的抗體，如單克隆抗體或多克隆抗體，也可直接商購用于檢測白細胞介素-8的試劑盒。所述試劑盒的使用方法如下取ImL待測患者的外周血于細胞培養板，加入IOuL 結核分枝桿囷總蛋白標準液，混勾，在37 C>5% CO2條件下放直24h ;然后將血液樣品全部轉移至新的I. 5mL離心管，室溫下3000rpm離心10分鐘，收集上清液，用PBS緩沖液稀釋至 200倍體積，作為待測溶液，檢測其中的白細胞介素-8含量。所述結核分枝桿菌總蛋白標準液的具體制備方法如下將無菌的結核分枝桿菌總蛋白溶液用無菌PBS緩沖液稀釋至蛋白濃度為lmg/mL，即為結核分枝桿菌總蛋白標準液。所述結核分枝桿菌總蛋白是將結核分枝桿菌進行總蛋白提取得到的。所述結核分枝桿菌總蛋白可按如下方法制備將結核分枝桿菌破碎菌體并收集上清液，然后用0. 22 y m無菌濾器進行過濾，獲得無菌的結核分枝桿菌總蛋白溶液。所述結核分枝桿菌總蛋白具體可按如下方法制備取IOOmL OD600 = I的結核分枝桿菌菌液，4°C、3000g離心lOmin，收集菌體，洗滌后用ImL 4°C預冷的PBS緩沖液重懸；然后加入0. Imm 二氧化娃珠子,在FastPrep-24儀器上以6. 5m/s(米/秒)的振蕩速度破碎I分鐘，4°C、IOOOOg離心lOmin，取上清液；將上清液用0. 22 y m無菌濾器進行過濾，獲得無菌的結核分枝桿菌總蛋白溶液。所述輔助診斷結核病患者具體指的是輔助診斷結核病患者是否治愈、輔助診斷待測患者是否為結核病患者或輔助診斷結核病患者的嚴重程度(如細菌載荷量和肺部病理損傷程度)。本發明還保護結核分枝桿菌和用于檢測白細胞介素-8的物質在制備輔助診斷結核病患者的試劑盒中的應用。所述結核分枝桿菌具體可為H37Rv標準株。所述用于檢測白細胞介素-8的物質為白細胞介素-8的抗體，如單克隆抗體或多克隆抗體，也可直接商購用于檢測白細胞介素-8的試劑盒。所述輔助診斷結核病患者具體指的是輔助診斷結核病患者是否治愈、輔助診斷待測患者是否為結核病患者或輔助診斷結核病患者的嚴重程度(如細菌載荷量和肺部病理損傷程度)。本發明的發明人發現將待測患者的外周血用結核分枝桿菌總蛋白誘導后，結核病患者和健康者之間，不同嚴重程度的結核病患者之間(臨床上，結核病診斷及病情轉歸評估的主要依據是細菌學檢測及影像學檢測結果，因此，本發明分析了 IL-8含量與細菌學檢測及影像學檢測結果之間的相關性)，同一結核病患者的不同病程階段之間，白細胞介素-8(InterleUkin-8，IL-8)的表達量均有顯著差異，可以通過該表達量差異輔助診斷結核病患者(該診斷包括診斷不同嚴重程度的結核病患者，診斷同一結核病患者的不同病程階段以及診斷該患者的結核病是否治愈)。應用本發明的試劑盒輔助診斷結核病患者，不涉及傳染性痰樣品，具有良好的安全性和實用性，同時可以在2天內給出結果，具有快速、簡便等特點。


圖I為實施例2的標準曲線。圖2為痰菌陽性的結核病患者、痰菌陰性的結核病患者及健康人的IL-8含量(* 表示 p < 0. 01)。圖3為實施例3的標準曲線。圖4為肺部有空洞的結核病患者、肺部以結核結節為主的結核病患者及健康人健康人的IL-8含量(*表示p < 0. 01)。圖5為實施例4的標準曲線。圖6為10名患者在不同階段的IL-8含量。圖7為發病(治療前)、治療中、治療最后一個月、治愈停藥3個月的患者的IL-8 含量(*表示P < 0. 01)。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。Difco Middlebrook 7H9培養基(又稱Middlebrook 7H9液體培養基)購自BD公司。結核分枝桿菌H37Rv標準株:ATCC編號為27294，可從國家參比實驗室菌株庫獲取。實施例中所用的PBS緩沖液均為pH7. 4,0. IM的PBS緩沖液。實施例中的各個患者均為知情同意的志愿者。實施例I、結核分枝桿菌總蛋白(MTB總蛋白)的制備I、用Middl ebrook 7H9液體培養基震蕩培養H37Rv標準株至OD6tltl = I。2、取IOOmL菌液，4°C、3000g離心lOmin，收集菌體，用PBS緩沖液洗2次，然后用 ImL 4°C預冷的PBS緩沖液重懸。3、加入 I 管 0. Imm 二氧化娃珠子(購自 MP Biochemicals),在 FastPrep-24 儀器 (購自MP Biochemicals)上以6. 5m/s (米/秒)的振蕩速度破碎I分鐘，4°C、IOOOOg離心 IOmin,取上清液。4、將上清液用0. 22 ii m無菌濾器進行過濾，獲得無菌的MTB總蛋白溶液。5、將無菌的MTB總蛋白溶液用BCA法進行蛋白濃度定量，并用無菌PBS緩沖液稀釋至蛋白濃度為lmg/mL，即為MTB總蛋白標準液，分裝并保存于_70°C。實施例2、細菌學檢查嚴重程度不同的患者血清中IL-8含量的差異一般認為，痰菌陽性表明患者向外排菌，具有傳染性，而且病情較為嚴重，而痰菌陰性表明患者不排菌，沒有傳染性，且病情較為緩和。實驗樣本分別為17名痰菌陽性的結核病患者(第一組)、32名痰菌陰性的結核病患者(第二組)和22名健康人(未患結核病；第三組)。第一組和第二組均是醫院確診的結核病患者，痰菌陽性和痰菌陰性的劃分標準如下從患者痰液樣本中進行結核分枝桿菌的分離培養，如果能獲得結核分枝桿菌為痰菌陽性，如果不能獲得結核分枝桿菌為痰菌陰性。將各個實驗樣本分別進行如下步驟一、采血及抗原刺激I、用EDTA抗凝真空抽血管抽取2mL外周血，上下顛倒混勻。2、取ImL外周血于細胞培養板，加入10 ii L MTB總蛋白標準液，輕搖混勻，在37 °C、 5% CO2條件下放置24h。3、將完成步驟2的血液樣品全部轉移至干凈的I. 5mL離心管，室溫下，3000rpm離心10分鐘，收集上清液，用PBS緩沖液稀釋至200倍體積，作為待測溶液。二、檢測IL-8含量利用人IL-8雙抗夾心ELISA試劑盒(購自Raybio公司，型號為ELH-IL-8-001 ;包括如下組件將IL-8標準品、IL-8單抗預包被酶標板、Wash Buffer、生物素標記的IL-8多克隆抗體、HRP標記抗生物素抗體、TMB底物、終止液)檢測步驟一得到的上清液中的IL-8 含量，具體步驟如下I、取IL-8單抗預包被酶標板；將IL-8標準品用PBS緩沖液梯度稀釋，每個濃度設置三個復孔，每孔加入IOOil L ;在其它孔中加入步驟一得到的待測溶液，設置三個復孔，每孔加入IOOiI L。2、將步驟I的酶標板室溫輕搖反應3小時，用300 ii L Wash Buffer洗板，重復4 次。3、將步驟2的酶標板加入生物素標記的IL-8多克隆抗體，每孔加入100 U L,室溫輕搖反應2小時，用300 ii L Wash Buffer洗板，重復4次。4、將步驟3的酶標板加入HRP標記抗生物素抗體，每孔加入100 U L,室溫輕搖反應 I小時，用300 ii L Wash Buffer洗板，重復4次。5、將步驟4的酶標板加入TMB底物，每孔加入100 U L，室溫輕搖反應15分鐘。6、將步驟5的酶標板加入終止液，每孔加入50 u L，然后立即在450nm波長下檢測
吸光值。根據標準品的吸光值繪制標準曲線，見圖1，標準曲線方程為y = 111. 57x-12. 223 (R2 = 0. 9988)。根據標準曲線方程計算各組實驗樣本每毫升外周血中的IL-8檢測值(IL-8含量) 平均值見表I和圖2。表I各組的IL-8檢測值(pg/mL)
權利要求
1.輔助診斷結核病患者的試劑盒，包括結核分枝桿菌總蛋白和用于檢測白細胞介素-8的物質。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述結核分枝桿菌總蛋白是將結核分枝桿菌進行總蛋白提取得到的。
3.結核分枝桿菌總蛋白和用于檢測白細胞介素-8的物質在制備輔助診斷結核病患者的試劑盒中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述結核分枝桿菌總蛋白是將結核分枝桿菌進行總蛋白提取得到的。
5.輔助診斷結核病患者的試劑盒，包括結核分枝桿菌和用于檢測白細胞介素-8的物質。
6.結核分枝桿菌和用于檢測白細胞介素-8的物質在制備輔助診斷結核病患者的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種輔助診斷結核病患者的試劑盒。本發明提供的試劑盒包括結核分枝桿菌總蛋白和用于檢測白細胞介素-8的物質。將待測患者的外周血用結核分枝桿菌總蛋白誘導后，結核病患者和健康者之間，不同嚴重程度的結核病患者之間，同一結核病患者的不同病程階段之間，白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)的表達量均有顯著差異，可以通過該表達量差異輔助診斷結核病患者(該診斷包括診斷不同嚴重程度的結核病患者，診斷同一結核病患者的不同病程階段以及診斷該患者的結核病是否治愈)。
文檔編號G01N33/569GK102590502SQ20121000689
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者張旭霞, 李傳友, 車南穎 申請人:北京市結核病胸部腫瘤研究所