專利名稱：檢測單鏈和/或雙鏈dna的分子探針及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于材料制備技術領域，涉及一種檢測單鏈和/或雙鏈DNA的分子探針及其應用；具體是一種基于Ru配合物作為熒光分子探針，其應用在于其能夠與單鏈 DNA(ssDNA)或者雙鏈DNA(dsDNA)作用從而產(chǎn)生熒光信號。
背景技術：
核酸作為遺傳信息的重要載體，在生物傳感體系的研究應用中，核酸的檢測分析一直是一項非常重要的研究內(nèi)容，其中DNA的特異性識別在基因組學、疾病診斷、病毒學、 分子生物學等領域越來越得到更多的重視和研究。現(xiàn)有技術對雙鏈DNA(dsDNA)的研究已經(jīng)較為普遍和成熟，然而，能夠檢測單鏈DNA分子的熒光分子探針卻相對較少，能夠同時對單鏈DNA (ssDNA)和雙鏈DNA進行簡單快速、低成本、高靈敏的識別存在較大的挑戰(zhàn)，而這些技術正是在DNA檢測分析中極為重要的一環(huán)。近年來，吸光度法、熒光法、瑞麗光散射法、化學發(fā)光法以及電化學法在核酸分析中得到普遍的應用，其中因熒光法具有操作簡便，高靈敏度和可見性等特點得到廣泛的研究。自Barton等人在研究一系列Ru(II)多批唳類配合物與核酸相互作用時發(fā)現(xiàn)，其在水溶液中沒有熒光，而當溶液里有dsDNA存在時有很強的熒光，因此把它們稱為核酸分子“光開關”。近年核酸分子“光開關”型探針得到了廣泛深入的研究，合成開發(fā)特異性的熒光探針成為DNA熒光傳感策略中的關鍵，[Ru(bpy)2dppz]2+是DNA分子開關中最為經(jīng)典的一種， 目前已知文獻中，大都是對[Ru(bpy)2dppz]2+作為dsDNA探針的研究,然而，還未見利用 [Ru(bpy)2dppz]2+來檢測ssDNA分子的報道。盡管關于[Ru (bpy) 2 (dppz)]2+的研究已經(jīng)近20年了，其與DNA的鍵合機理的一直備受爭議，目前較多認可的是此探針的dppz配體通過插層作用插入到雙鏈DNA中。然而， 在2009年Barton課題組發(fā)現(xiàn)該探針存在的多種異構(gòu)體與DNA的鍵合方式都存在差異，如 Δ (右手異構(gòu))型配合物容易鍵合B-DNA，而Λ (左手異構(gòu))型配合物容易鍵合Z-DNA[1]。 導致這種結(jié)果的主要原因是由于探針的空間結(jié)構(gòu)不同從而使鍵合方式發(fā)生改變。本發(fā)明涉及的參考文獻[l]Lim，Μ. H.，et al.，Sensitivity of Ru (bpy) (2) dppz (2+) Luminescence to DNA Defects. Inorganic Chemistry,2009. 48 (12) p. 5392-5397.[2] Friedman, A. E.，et al.，A molecular light switch for DNA Ru (bpy)2 (dppz)2+.Journal of the American Chemical Society,1990. 112 (12) p. 4960-4962.[3] HolmLin, R . E .，E . D . A . Stemp，and J . K . Barton， Ru (phen)2dppz2+Luminescence-Dependence on DNA Sequences and Groove-Binding Agents. Inorganic Chemistry, 1998. 37 (I) p. 29-34.[4]Wang, J. ， et al. ， Aptamer-BasedATP Assay Using a Luminescent Light Switching Complex. Analytical Chemistry,2005. 77(11) p.3542-3546.
[5] Barton, J. K. , E. D. Olmon, and P. A. Sontz, Metal complexes for DNA-mediated charge transport. Coordination Chemistry Reviews,2011. 255(7-8) p. 619-634.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是通過優(yōu)化合成方法而提供一種能夠檢測ssDNA和/ 或dsDNA的分子探針，使得本發(fā)明的分子探針合成過程簡單可控，得到的分子探針可以簡單快速反映出溶液中是否存在DNA分子，且本發(fā)明最大的優(yōu)點在于可直接有效檢測溶液中的ssDNA和/或dsDNA，免除因使用昂貴的帶有熒光標記的DNA探針而導致操作步驟繁瑣， 檢測成本高的問題。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案如下一、一種化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針(名稱2，2’ -聯(lián)吡啶二吡啶并[3，2_a:2’， 3’ -c]吩嗪釕，簡稱[Ru(bpy)2dppz]2+);其特征在于其通過合成路線II所述的方法制備而得I)化合物I的合成將鄰菲噦啉與溴化鉀干燥后加入到充分冷卻的濃硫酸中，充分冷卻后再滴加HNO3 ;將反應體系加熱到40 50°C恒溫2小時，再升溫到80 90°C恒溫 2小時，再到120°C恒溫I小時，然后降溫到80°C恒溫一夜；冷卻到室溫后，中和反應體系至 pH = 6 7，減壓抽濾后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近無色得到化合物I粗產(chǎn)品。進一步地，粗產(chǎn)品在甲醇中重結(jié)晶，得到黃色固體純品；進一步地，對產(chǎn)物pH的調(diào)節(jié)中和時先用濃NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至無氣泡產(chǎn)生。2)化合物2的合成用乙醇溶解化合物I，然后滴加鄰苯二胺的乙醇溶液；回流兩小時得到淡黃色絮狀沉淀，減壓抽濾，重結(jié)晶后真空干燥得到海綿狀黃色固體即化合物2。3)化合物3的合成將N，N’_ 二甲基甲酰胺加入三氯化釕和2，2’-聯(lián)吡啶的混合體系，加熱回流4個小時后，蒸發(fā)掉將所得溶液的大部分溶劑，剩下的溶液冷卻至室溫后， 再加入丙酮并保持溫度0°C靜置24個小時，析出棕黑色的固體不溶物即化合物3粗產(chǎn)品。進一步地，將化合物3粗產(chǎn)品減壓抽濾并用蒸餾水洗滌粗產(chǎn)品兩次；再將所得粗產(chǎn)品放在水與乙醇為體積比I : I的混合溶液中加熱回流一個小時后過濾，再加入氯化鋰充分攪拌；最后蒸發(fā)溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷卻后再繼續(xù)放在冰浴中冷卻；靜置24 個小時后，溶液中析出黑色晶體；過濾，真空干燥得到化合物3純品。4)化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的合成將化合物3與化合物2按照摩爾比為1:1.1 的比例加入乙醇中，在氮氣保護下加熱回流直到反應溶液變?yōu)榧t色透明溶液為止，冷卻到室溫；蒸出大部分溶劑后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷卻，析出不溶物；經(jīng)過濾，洗滌， 旋蒸，重結(jié)晶，得到化學結(jié)構(gòu)式I的探針分子；
權(quán)利要求
1.一種化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針，其特征在于其通過合成路線II所述的方法制備而1)化合物I的合成將鄰菲啰啉與溴化鉀干燥后加入到充分冷卻的濃硫酸中，充分冷卻后再滴加HNO3 ;將反應體系加熱到40 50°C恒溫2小時，再升溫到80 90°C恒溫2 小時，再到120°C恒溫I小時，然后降溫到80°C恒溫一夜；冷卻到室溫后，中和反應體系至 pH=6 7，減壓抽濾后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近無色得到化合物I粗產(chǎn)品；2)化合物2的合成用乙醇溶解化合物1，然后滴加鄰苯二胺的乙醇溶液；回流兩小時得到淡黃色絮狀沉淀，減壓抽濾，重結(jié)晶后真空干燥得到海綿狀黃色固體即化合物2 ；3)化合物3的合成將N，N’-二甲基甲酰胺加入三氯化釕和2，2’ -聯(lián)吡啶的混合體系，加熱回流4個小時后，蒸發(fā)掉將所得溶液的大部分溶劑，剩下的溶液冷卻至室溫后，再加入丙酮并保持溫度0°C靜置24個小時，析出棕黑色的固體不溶物即化合物3粗產(chǎn)品；4)化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的合成將化合物3與化合物2按照摩爾比為I: I. I的比例加入乙醇中，在氮氣保護下加熱回流直到反應溶液變?yōu)榧t色透明溶液為止，冷卻到室溫；蒸出大部分溶劑后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷卻，析出不溶物；經(jīng)過濾，洗滌，旋蒸，重結(jié)晶，得到化學結(jié)構(gòu)式I的探針分子；
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針，其特征在于所述的步驟I)的粗產(chǎn)品在甲醇中重結(jié)晶，得到黃色固體純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針，其特征在于所述的步驟I)對產(chǎn)物 pH的調(diào)節(jié)中和時先用濃NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至無氣泡產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針，其特征在于所述的步驟3)將化合物3粗產(chǎn)品減壓抽濾并用蒸餾水洗滌粗產(chǎn)品兩次；再將所得粗產(chǎn)品放在水與乙醇為體積比1:1的混合溶液中加熱回流一個小時后過濾，再加入氯化鋰充分攪拌；最后蒸發(fā)溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷卻后再繼續(xù)放在冰浴中冷卻；靜置24個小時后，溶液中析出黑色晶體；過濾，真空干燥得到化合物3純品。
5.權(quán)利要求I所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的制備方法，其特征在于其通過合成路化合物2 II。線II所述的方法制備而得1)化合物I的合成將鄰菲啰啉與溴化鉀干燥后加入到充分冷卻的濃硫酸中，充分冷卻后再滴加HNO3 ;將反應體系加熱到40 50°C恒溫2小時，再升溫到80 90°C恒溫2 小時，再到120°C恒溫I小時，然后降溫到80°C恒溫一夜；冷卻到室溫后，中和反應體系至 pH=6 7，減壓抽濾后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近無色得到化合物I粗產(chǎn)品；2)化合物2的合成用乙醇溶解化合物1，然后滴加鄰苯二胺的乙醇溶液；回流兩小時得到淡黃色絮狀沉淀，減壓抽濾，重結(jié)晶后真空干燥得到海綿狀黃色固體即化合物2 ；3)化合物3的合成將N，N’-二甲基甲酰胺加入三氯化釕和2，2’ -聯(lián)吡啶的混合體系，加熱回流4個小時后，蒸發(fā)掉將所得溶液的大部分溶劑，剩下的溶液冷卻至室溫后，再加入丙酮并保持溫度0°C靜置24個小時，析出棕黑色的固體不溶物即化合物3粗產(chǎn)品；4)化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的合成將化合物3與化合物2按照摩爾比為I: I. I的比例加入乙醇中，在氮氣保護下加熱回流直到反應溶液變?yōu)榧t色透明溶液為止，冷卻到室溫；蒸出大部分溶劑后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷卻，析出不溶物；經(jīng)過濾，洗滌，旋蒸，重結(jié)晶，得到化學結(jié)構(gòu)式I的探針分子；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的制備方法，其特征在于所述的步驟I)的粗產(chǎn)品在甲醇中重結(jié)晶，得到黃色固體純品。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的制備方法，其特征在于所述的步驟I)對產(chǎn)物pH的調(diào)節(jié)中和時先用濃NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至無氣泡產(chǎn)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的制備方法，其特征在于所述的步驟3)將化合物3粗產(chǎn)品減壓抽濾并用蒸餾水洗滌粗產(chǎn)品兩次；再將所得粗產(chǎn)品放在水與乙醇為體積比1:1的混合溶液中加熱回流一個小時后過濾，再加入氯化鋰充分攪拌；最后蒸發(fā)溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷卻后再繼續(xù)放在冰浴中冷卻；靜置24個小時后，溶液中析出黑色晶體；過濾，真空干燥得到化合物3純品。
9.權(quán)利要求I所述的化學結(jié)構(gòu)式I的分子探針的應用，其特征在于將化學結(jié)構(gòu)式為I 的分子探針與單鏈和/或雙鏈DNA溶解于HCl-Tris緩沖液中配制成水溶液，復合所得到的熒光探針用于單鏈和/或雙鏈DNA的熒光分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述的Tris-HCl為弱酸性或弱堿性。
全文摘要
本發(fā)明屬于材料制備技術領域，涉及一種檢測單鏈和/或雙鏈DNA的分子探針及其應用。本發(fā)明通過對現(xiàn)有技術中的合成方法進行了優(yōu)化，并優(yōu)化合成了[Ru(bpy)2(dppz)]2+，發(fā)現(xiàn)其具有單鏈和雙鏈兩種探針的作用。發(fā)明人初步認為是通過合成方法的優(yōu)化造成了其分子的空間構(gòu)形發(fā)生了改變，即通過本發(fā)明所述的合成方法得到的異構(gòu)體與DNA的鍵合方式都存在差異，使得本發(fā)明的分子探針具有單鏈探針的作用，發(fā)明人將對該作用機理進行進一步的探索研究。
文檔編號G01N33/542GK102590494SQ201210006970
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者劉會祥, 唐雪梅, 宋榮斌, 梅亞軍, 田丹碧, 馬玉潔 申請人:南京工業(yè)大學