專利名稱：一種檢測食品中三聚氰胺含量的elisa方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測食品中三聚氰胺含量的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)，屬于食品安全監督或食品分析的研究領域。
背景技術：
三聚氰胺(melamine)，化學名稱為2，4，6-三氨基-1，3，5_三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺等，是一種重要的氮雜環有機化工原料，用途十分廣泛。三聚氰胺最主要的用途是作為生產三聚氰胺甲醛樹脂(MF)的原料，被廣泛運用于木材、塑料、造紙、紡織、皮革等行業；三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等。由于三聚氰胺分子中含有大量氮 元素，而常規的“凱氏定氮法”測飼料或食品中蛋白質含量時不能排除這類“偽蛋白氮”的干擾，因而一些不法分子為降低成本在小麥粉、大米粉、飼料、奶粉等植物性或動物性高蛋白類食品中添加這種非食品性化工原料，以提高其產品中的蛋白質含量。2007年，美國爆發寵物食品受污染事件。事后調查表明摻雜了彡6. 6%三聚氰胺的小麥蛋白粉是寵物食品導致中毒的原因。2008年9月，中國爆發三鹿嬰幼兒奶粉受污染事件，導致食用了受污染奶粉的嬰幼兒產生腎結石病癥，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。根據美國食物及藥物管理局(FDA)的標準，三聚氰胺每日可容忍攝入量為每日O. 63毫克/公斤體重。FDA指出，除嬰兒食品外，普通食物中含有三聚氰胺和其類似物質限量值為
2.5mg/kg，嬰兒食品中則不應該含有任何劑量的三聚氰胺。歐盟、澳大利亞和新西蘭等許多國家和地區也普遍采用2. 5mg/kg為最低檢出值。2008年10月7日，我國衛生部、工業與信息化部、農業部、國家工商管理總局、國家質檢總局五部門聯合制定了乳品中三聚氰胺管理限量值，嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為lmg/kg ;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2. 5mg/kg。現有的文獻報道的三聚氰胺的檢測方法主要有重量法(包括苦味酸法及升華法)、電位滴定法、液相色譜檢測法、液相色譜-質譜聯用檢測法、氣相色譜-質譜檢測法以及試劑盒檢測法(ELISA)等。前三種方法對儀器的要求較低，但前處理方法和檢測限不能達到目前對食品中三聚氰胺的檢測要求。高效液相色譜法簡便、快速，適用于食品中含量較高的三聚氰胺的定量工作，若同時利用二極管陣列檢測器可作初步定性，成本低于質譜法，易于推廣。而液質聯用法不需要進行衍生化，簡化了樣品處理的步驟，與氣相色譜質譜聯用法和液相色譜法相比，具有高靈敏度和高選擇性的特點，更適合于食品中三聚氰胺的快速篩查和定量分析。我國已有GB/T22388-2008和GB/T22400-2008兩個標準，包含了 HPLC法和HPLC-MS法，并把HPLC法作為快速篩分原料乳中三聚氰胺的手段。HPLC-MS也是美國FDA用于檢測和定量食品中三聚氰胺的基本分析方法，其檢測限可達ppb級。酶聯免疫吸附法則比較簡單快速，可以節約較多的資源。現在市場上已有三聚氰胺的試劑盒出售和相關文獻的報道。國內已有申請ELISA測定食品中三聚氰胺含量的專利，如專利號為CN101206223A (中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所)，專利號為CN101407580A (吉林大學)，專利號為CN101429243A (浙江大學)。但是所報道的方法的檢測靈敏度均不夠高，不能很好的滿足現實生活中對三聚氰胺檢測的需要。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種檢測食品中三聚氰胺含量的酶聯免疫吸附分析方法，其特點是基于抗原與抗體之間特異性反應而建立的分析方法。本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外均為重量份數。檢測食品中三聚氰胺含量的酶聯免疫吸附分析方法三聚氰胺完全抗原的制備及檢測食品中三聚氰胺含量的ELISA方法，包括以下步驟步驟一三聚氰胺修飾物的制備；步驟二 免疫原和包被抗原的制備； 步驟三三聚氰胺單克隆抗體的制備；步驟四建立測定三聚氰胺的酶聯免疫吸附分析方法；步驟五ELISA對加標樣品中三聚氰胺含量的測定。其中，所述步驟一包括I)三聚氰胺半抗原A (Hapten A)的合成稱取2-氯-4，6- 二氨基-1，3，5_三嗪(CAAT)加入反應瓶，用無水甲醇溶解，再加入對氨基苯甲酸溶于氫氧化鉀的無水甲醇中。反應回流5 12小時，直到CAAT反應完全。反應混合物過濾，并用無水乙醇和蒸餾水各洗三次，得到白色粗產物。再用甲醇/ 二氯甲烷按一定的溶劑比過柱，得到純品。其反應式如下
權利要求
1.一種檢測食品中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 步驟一三聚氰胺修飾物的制備； 步驟二 免疫原和包被抗原的制備； 步驟三三聚氰胺單克隆抗體的制備； 步驟四建立測定三聚氰胺的酶聯免疫吸附分析方法； 步驟五=ELISA對加標樣品中三聚氰胺含量的測定。
2.根據權利要求I所述的方法，其中，所述步驟一包括 1)三聚氰胺半抗原A(Hapten A)的合成 稱取2-氯-4，6- 二氨基-1，3，5-三嗪(CAAT)加入反應瓶，用無水甲醇溶解，再加入對氨基苯甲酸溶于氫氧化鉀的無水甲醇中；反應回流5 12小時，直到CAAT反應完全；反應混合物過濾，并用無水乙醇和蒸餾水各洗三次，得到白色粗產物；再用甲醇/ 二氯甲烷按一定的溶劑比過柱，得到純品；其反應式如下
3.根據權利要求I所述的方法，其中，所述步驟二包括 分別稱取Hapten A或Hapten B,或Hapten C和二環己基碳二亞胺，N-輕基琥拍酰亞胺，一同溶解于二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌過夜，將混合液離心5 20分鐘，取上層清液，緩慢加入到O. 0Γ0. 02%的牛血清白蛋白即BSA和O. 0Γ0. 02%卵清白蛋白即0VA，攪拌Γ10小時，離心分離，取上層清液，透析數天，溶液冷凍干燥，置冰箱中存放，其中，HaptenA-BSA、Hapten B-BSA 和 Hapten C-BSA 為免疫原；Hapten A-OVA> Hapten B-0VA 和 HaptenC-OVA為包被抗原，即分別是包被抗原A、包被抗原B和包被抗原C。
4.根據權利要求I所述的方法，其中，所述步驟四包括 (1)溶液配制； (2)間接競爭ELISA步驟； (3)ELISA的優化條件和靈敏度； (4)ELISA的標準曲線； (5)ELISA的特異性。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(I)溶液配制包括 (a).碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液； (b).磷酸緩沖液； (c).酪蛋白溶液； (d).磷酸緩沖液-吐溫儲備液； (e).底物溶液；(f)· H2SO4 溶液； (g)RPMI-IMO 培養液。
6.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(2)間接競爭ELISA步驟包括 (a).加入包被抗原于酶標板中，每孔200μ L，冰箱4°C過夜； (b)·用PBST緩沖液，PBST儲備液，1:10稀釋，350 μ L/孔，洗板三次； (c).加入酪蛋白進行封阻，每孔300μ L，室溫保溫保濕放置I小時；(d).用PBST緩沖液洗板三次； (e).在酶標板的每孔中依次分別加入100μ L標準溶液和100 μ L一定稀釋度的單克隆抗體，室溫保溫保濕放置I小時； (f)·用PBST緩沖液洗板三次； (g).加入酶標二抗(羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶，GaMIgG-HRP),每孔200μ L，室溫保溫保濕放置I小時； (h).用PBST緩沖液洗板三次； (i).加入底物溶液，每孔200μ L，室溫保溫保濕避光反應，在微量振蕩器上振搖約15 25分鐘； (j) ·加入5%H2S04溶液，每孔5(Γ100 μ L，終止酶反應； (k).用酶標儀測定吸光度，作出標準曲線，進行結果分析與討論。
7.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(3)ELISA的優化條件和靈敏度 包括抗原濃度為10(T2000ng/mL ;抗體稀釋度為I :2000(Tl :50000 ;羊抗兔辣根過氧化物酶稀釋度為I :500(Tl :10000 ;封阻液為l%casein ;孵育時間為Ih ;顯色時間為15min。
8.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(4)ELISA的標準曲線包括 分別選用包被抗原A、包被抗原B和包被抗原C作為包被抗原，考察了 ELISA的靈敏度； 分別以目標物濃度的對數為橫坐標，以相對信號B/BplOO。/。為縱坐標作出標準曲線； B0 :標準濃度為Ong/mL所對應的吸光度；B :其它標準濃度所對應的吸光度。
9.根據權利要求4所述的方法，其中，所述(5)ELISA的特異性包括 ELISA特異性可用交叉反應率的大小來表示； 交叉反應率CR%=三聚氰胺的IC5tl/測試物質的IC5tlX 100% ； 交叉反應率越小，ELISA的特異性越高。
10.根據權利要求I所述的方法，其中，所述步驟五包括 選擇四種樣品純牛奶、奶粉、豬飼料和雞飼料進行加標反應實驗；同一樣品取兩份，一份加入適量的三聚氰胺溶液，一份作為空白樣品；純牛奶樣品稀釋后直接用ELISA測定，奶粉樣品用PH=7. 4磷酸緩沖液溶解后稀釋直接用ELISA測定，動物飼料樣品加入三氯乙酸溶液，超聲提取20min后，4°C下lOOOOg/lOmin離心，上清稀釋后用ELISA直接測定。
全文摘要
本發明公開了檢測食品中三聚氰胺含量的酶聯免疫吸附分析方法(ELISA)。其特點是合成了三種不同的三聚氰胺半抗原衍生物，并將衍生物與載體蛋白質交聯，合成三種免疫原和包被抗原，運用雜交瘤單抗制備技術制得單克隆抗體。四種樣品即純牛奶、奶粉、雞飼料和豬飼料中加入不同量的三聚氰胺，并用ELISA直接測定，加標回收率為72.6–133.3%，相對標準偏差為0.8–18.9%；加標樣品同時用HPLC和ELISA檢測并比較測定結果，回歸曲線為Y=1.5589x-1.4004，線性相關系數為0.9902，表明兩種方法有較好的相關性。
文檔編號G01N33/531GK102879572SQ20121036337
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者鄧安平, 曹碧云, 楊紅, 宋娟 申請人:蘇州大學