專利名稱：一種脂肪細胞分化代謝產物igf-1抗體及包含該抗體的芯片以及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種脂肪細胞分化代謝產物IGF-I抗體及包含該抗體的芯片以及應用。
背景技術：
正常的脂肪代謝是機體生長發育的重要生理過程，其機制是復雜多向的機體整體變化，涉及到眾多蛋白、細胞因子的上調或下調，而異常的脂肪代謝將導致肝臟損傷、高血壓、內分泌失調、肥胖等疾病的發生，這些疾病的發病機理是一個漫長的發展過程，與個體的生活及飲食等習慣密不可分。目前中國的醫療水平和診斷技術還僅局限于傳統的檢測方法對單一疾病的診斷，而脂肪細胞分化標志物芯片的研制可將相關疾病進行橫向比對，控 制其并發癥的發生，更加有效地指導臨床用藥，提高了診療水平，縮短了與國際同行之間的差距。隨著中國老齡化進程的加快，以上疾病的發病率會逐年增多，此芯片的研制將在正常體檢、疾病的預防和控制方面做出積極和重大的貢獻。本發明包括IGF-I在內的45種單克隆抗體與脂肪細胞分化代謝產物中的蛋白質的結合具有高度特異性，涵蓋脂肪因子、疾病相關因子及細胞分化標志因子等。所制成的抗體芯片實現了對糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓、肥胖等疾病高通量檢測技術平臺，自主研發脂肪細胞分化代謝產物抗體芯片檢測試劑盒(抗體芯片)完全是由中國人自主開發，應用這一芯片，可通過多種方式、多種渠道、多層面檢測脂肪細胞分化代謝產物的效價和含量，將檢測靈敏度由Ug提高到ng級，從而達到更準確、更全面的效果，其檢測結果即可定性也可定量。脂肪細胞分化代謝產物抗體芯片檢測試劑盒(抗體芯片)對促進我國生物高技術前沿領域的發展具有重大鼓舞作用，對提升我國生物芯片技術、產品和市場的國際競爭力具有重大意義，此方法完全符合分子免疫學原理。目前國外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了生物芯片技術來尋找藥物靶標，查檢藥物的毒性或副作用及進行藥物產品的定量和定性。用芯片技術進行大規模的藥物篩選可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，從而帶動創新藥物的研究和開發。

發明內容
本發明的目的在于提供脂肪細胞分化代謝產物IGF-I的單克隆抗體及包含該抗體的芯片以及應用。本發明的整體技術構思是利用細胞融合、亞克隆及酶聯免疫吸附實驗進行特異性篩選技術，獲得高效價、高特異性抗人脂肪細胞分化代謝產物單克隆抗體，由于此單抗效價高、特異性好，可直接應用于芯片的點樣，結合CY3標記的補體C3抗體與被檢產品建立了完整的檢測系統檢測檢測45種脂肪分化代謝蛋白質含量的方法.此抗體芯片具有靈敏度高，特異性好、操作簡單、高通量等優點，可用于臨床和體檢血清的監測和質控。本發明提供的IGF-I單克隆抗體，其重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，其輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有與脂肪細胞分化代謝產物IGF-I特異性結合的特性。作為優選，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結合結構域的任何多肽。本發明所述“抗體”應該解釋為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性結合因子。因而，這個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結合結構域的任何多肽，無論是天然的還是合成產生的。抗體的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以 是包含抗原結合結構域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結合結構域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本發明所述單克隆抗體可以是，例如，單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結合結構域的任何多肽。抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術來產生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區或互補性決定區(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區或恒定區加框架區。參見，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。還可以對雜交瘤細胞或產生抗體的其它細胞進行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產生抗體的結合特異性。用于本發明的單克隆抗體也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發明人源化抗體的DNA序列可用本領域技術人員熟知的常規手段，如根據本發明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體中。最后，在適合本發明抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞，然后本領域技術人員應用熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的單克隆抗體。如上所述，本發明還提供了用于實施本發明抗體的試劑、試劑盒或芯片。試劑、試劑盒或芯片至少包括如下一種或多種根據以上方法制成的抗體，編碼該抗體的核苷酸，或包含該抗體的真核細胞、原核細胞和病毒以及任選的緩沖溶液。本發明所述芯片上還包含特異性結合以下脂肪細胞分化代謝產物的抗體TNF- a、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4>GLUT-4> LPL>PGAR、UCPs, PPAR- y、C/EBP、ADDl、SREBPl、NPY、MC-4R、POMC, a -MSH、AgRP、orexin、GH、IGF-I、Acrp30、VEGF、HBEGF,HGF,Ang II、ACE、AGT、FA transporter, eNOS、iNOS、ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase、AP2、apoE、perilipin、ACBP, PEPCK, A2-腎上腺素能受體。本發明還提供包含所述抗體芯片的試劑盒，其特征在于，還包含信標分子標記的C3補體抗體，所述信標分子優選為CY3。在具體實施方式
中，本發明公開了脂肪細胞分化代謝產物抗體芯片的制備方法，它包括如下工藝步驟(I)動物免疫將自主設計合成的IGF-I多肽(HPLC檢測純度大于90%，序列PTGYGSSSRRAPQTG)lml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度脂肪細胞分化代謝蛋白，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞并制成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按I :10比例混合，30秒內逐漸加入45%PEG (分子量4000)，靜止90秒，使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇培養基進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第七天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞 克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養并凍存；(5)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，I. 44 (吸光單位)濃度為lmg/ml。 (6)將C3補體抗體進行CY3標記(7)脂肪細胞分化代謝產物芯片微陣列點樣(每張芯片包括4-8個陣列，I個標準，3-7個檢測)標準陣列檢測范圍O. 01 100ng/ml，檢測陣列45種抗體(每種抗體2個點)。本發明的具體工藝步驟和各步驟中的工藝參數是步驟(I)將自主設計合成的IGF-I多肽(HPLC檢測純度大于90%) Iml加等量的完全福氏佐劑并經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8 12周，每只腹腔注射O. 2ml,間隔2周注射一次；采用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清。步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后15小時的Sp2/0細胞調整為9X 105/ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞。步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第I分鐘滴加4. 5ml培養液；間隔2分鐘滴加5ml培養液，然后加培養液50ml，以HAT選擇培養基按36%的孔為I個細胞/孔進行細胞培養。步驟(4)中是將細胞培養至覆蓋0% 20%孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。步驟(5)中選用的BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5X IO5雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位=1. 44時濃度為lmg/ml。步驟(6)中選用的是CY3對補體C3抗體的標記
步驟(7)中選用脂肪細胞分化代謝產物芯片微陣列點樣(每張芯片包括4-8個陣列，I個標準，3-7個檢測)標準陣列檢測范圍O. 01 100ng/ml，檢測陣列45種抗體(每種抗體2個點)。本發明所取得的進步在于所獲得的抗人IGF-I單克隆抗體經AKTA蛋白純化儀FPLC純化，其效價高、特異性非常好，與另44種與脂肪細胞分化代謝產物相關的單克隆抗體經有限稀釋點于芯片上，與標記的補體C3抗體和檢測樣本進行雜交，借助目前先進的芯片檢測儀器進行檢測。此技術與傳統的檢測方法比較，具有快速、操作便捷、高通量檢測的特點；并可快速、準確地進行定性和定量檢測。本發明將自主設計合成的IGF-I多肽經免疫動物、細胞融合、克隆化培養、以及大量的組織細胞原位特異性篩選從而獲得高效價、高特異性的抗人IGF-I單克隆抗體，此抗體與44種與脂肪細胞分化代謝產物相關的單克隆抗體制成的抗體芯片可直接應用于臨床檢測和基礎研究。單克隆抗體在生物學和醫學研究領域中具有極大的應用價值，是親和層析中重要的配體，是免疫組化中主要的抗體，是免疫檢驗中的新型試劑，是生物治療的導向武器。作為脂肪細胞分化代謝產物的檢測試劑，抗人脂肪細胞分化代謝產物單克隆抗體可 以充分發揮其優勢。單克隆抗體的特異性強，可將抗原抗體反應的特異性大大提高，減少了可能的交叉反應，使試驗結果可信度更大。單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應結果便于質量控制，利于標準化和規范化。
具體實施例方式本發明公開了一種脂肪細胞分化代謝產物IGF-I抗體及包含該抗體的芯片以及應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。在進一步闡述本發明之前，我們有必要認識到，本發明并不局限于描述的特定的實施方案，也就是說，在具體形式上可能存在著變化。還有一點需要提醒的是，由于本發明的范圍受附加的權利要求書的限制，因此，本文使用的術語只是為了描述特定實施方案的目的，而不是為了限制本發明的目的。術語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可以互換使用。這些術語均為本領域技術人員所熟知的術語，具體是指由能特異結合抗原的一種或多種多肽構成的蛋白質。抗體的一種形式構成了抗體的基本結構單元。這種形式是四聚物，它由兩對完全相同的抗體鏈構成，每一對都有一個輕鏈和一個重鏈。在每對抗體鏈中，輕鏈和重鏈的可變區聯合在一起共同負責結合抗原，而恒定區則負責抗體的效應器功能。目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和λ輕鏈，以及a，Y(IgG1, IgG2, IgG3,IgG4), δ，ε和μ重鏈或它們的其它類型等價物。全長的免疫球蛋白“輕鏈”(大約25kDa或大約214個氨基酸)包含一個由NH2-末端上大約110個氨基酸形成的可變區，以及一個COOH-末端上的K或λ恒定區。全長的免疫球蛋白“重鏈”(大約50kDa或大約446個氨基酸)，同樣包含一個可變區(大約116個氨基酸)，以及重鏈恒定區之一，例如Y (大約330個氨基酸)。術語“抗體”和“免疫球蛋白”包括任何同型體的抗體或免疫球蛋白，或保持與抗原特異結合的抗體片段，包括但不限于Fab，Fv, scFv和Fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及包含抗體的抗原結合部分和非抗體蛋白質的融合蛋白質。抗體可以被標記和檢測，例如，可以通過放射性同位素、能產生可檢測物的酶、熒光蛋白質、生物素等等進行標記并被檢測。抗體還可以結合于固相載體，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。該術語還包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能與抗原特異性結合的抗體片段和單克隆抗體。抗體還可以以多種形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab’)2，以及雙功能雜合抗體(例如文獻，Lanzavecchia 等，Eur. J. Immunol. , 1987 ；17,105)以及以單鏈形式(例如，Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1988 ;85，5879 和 Bird 等，Science, 1988 ;242，423，在此引用作為參考)存在。免疫球蛋白的重鏈或輕鏈可變區由三個超變區(也稱為“互補決定區”或⑶R)組成，這些超變區被框架區(FR)間隔。框架區和互補決定區的范圍已被精石角定義(參見〃Sequences of Proteins of Immunological Interest, 〃E. Kabat 等， U. S. Department of Health and Human Services, 1991)。此處所討論的所有抗體氨基酸序列的排序都參照Kabat系統。同一物種不同的輕鏈和重鏈框架區序列相對保守。抗體的框架區用于定位和校準CDR。CDR主要負責結合抗原的表位。嵌合抗體是其重鏈和輕鏈基因經過構建的抗體，特別是利用基因工程改造的屬于不同物種的抗體可變區和恒定區基因。例如，可以將鼠單克隆抗體基因的可變區片段連接到人抗體恒定區片段如Y I和Y3。例如治療用嵌合抗體是一種嵌合蛋白質，它由來源于兔抗體可變區片段或抗原結合區片段和人抗體恒定區或效應區結合(如由A. T. C. C.保藏登記號CRL 9688的細胞制備的抗Tac嵌合抗體)，當然，嵌合抗體的基因來源也可以使用其它哺乳動物物種。可以理解本發明設計和生產的人源化抗體可能會替代某些保守性氨基酸，這些氨基酸對抗原結合或抗體其他功能基本上沒有影響。換而言之，gly和ala ;val、ile和Ieu ；asp和glu ；asn和gin ；ser和thr ；lys和arg ；phe和tyr,以上各組合內部的氨基酸可相互取代。抗體重鏈或輕鏈的“可變區”是該鏈的N端成熟區域。所有區域、CDR和殘基編號均以序列比對、按已有的結構知識為基礎進行定義。框架區和CDR殘基的鑒定和編號按 Chothia 和他人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998 ;278,457)。VH是抗體重鏈的可變區。VL是抗體輕鏈的可變區，它可能具有K和λ同種型。K-I抗體具有K -I同種型而Κ-2抗體具有K -2同種型，V λ是可變的λ輕鏈。“相應的氨基酸”，是指當兩個或多個氨基酸序列比對時，位于相同位置(也就是它們彼此對應)的氨基酸殘基。抗體序列比對和編號的方法在Chothia，見上，Kabat，見上和其他中得到詳盡闡述。本領域普通技術人員已知(參見如Kabat 1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest, DHHS, Washington, DC),有時可以在抗體的一個或兩個氨基酸中制造一個、兩個或三個缺口和/或插入1、2、3或4個殘基或者至多約15個殘基(特別是在L3和H3⑶R中)，從而完成一次比對。“可取代位置”，指的是抗體的一個特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不會使抗體的結合活性顯著降低。鑒定可取代位置的方法和它們可以被如何取代在下面將進行更加詳細的描述。可取代位置也可以稱為“變異耐受位置”。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例I :本發明所述脂肪細胞分化代謝產物抗體的制備脂肪細胞分化代謝產物抗體的制備方法，包括如下工藝步驟(I)動物免疫將自主設計合成IGF-I多肽(PTGYG SSSRRAPQTG)lml充分乳化，分別免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人脂肪細胞分化代謝產物，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗 血清；(2)分離脾細胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞并制成細胞懸液；(3)細胞融合將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按I :10比例混合，加入PEG使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇培養基進行細胞培養；(4)篩選雜交瘤細胞待融合的細胞培養至第七天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，然后進行抗原特異性免疫組織化學原位測定，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養并凍存；(5)單克隆抗體特異性篩選選經酶聯免疫吸附實驗檢測抗體效價大于I :10000的陽性孔的上清，與多種其它基因工程藥物進行特異性篩選。(6)單克隆抗體純化保存選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，I. 44 (吸光單位)濃度為 lmg/mlο步驟(I)將自主設計合成IGF-I多肽Iml加等量的完全福氏佐劑并經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在9周，每只腹腔注射O. 2ml,間隔2周注射一次；測定抗血清。步驟(2)進行完畢后采用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清，該方法由如下操作步驟組成a、包被以50mmol/L、pH=9的碳酸鹽緩沖液將步驟(I)中的自主設計合成IGF-1多肽包被96孔聚乙烯板，4微克/孔，真空抽干，密封4°C保存備用。b、封閉每孔加入pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液200 μ I洗滌、內含1%山羊血清；C、加樣每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50 μ I (1:5000稀釋),每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩沖液)，洗滌；d、加入酶標二抗每孔100 μ 1，洗滌；e、顯色
每孔加入底物100 μ I ;f、比色以空白調零，405nm波長測定光密度(0.D)；g、結果判斷P/N=測定標本O. D均值/陰性血清O. D均值，P/N彡2. I為陽性。步驟a中的聚乙烯板規格為200 μ I/孔、真空抽干溫度為4°C，洗滌采用O. 05%的Tween-20磷酸鹽緩沖液洗漆3次。步驟b中的工藝參數為每孔加入pH=7. 4、含1%山羊血清磷酸鹽緩沖液200 μ 1，溫度為37°C、時間I小時，洗滌3次。步驟c中的工藝條件為每孔加入1:5000稀釋后的第三次免疫后3天的小鼠外周 血清50 μ 1，每板設一正常對照、陽性對照及空白(磷酸鹽緩沖液)，溫度為37°C、時間為I小 時，洗滌3次。步驟d中的工藝條件加入酶標二抗每孔100 μ 1，溫度為37°C、時間為I小時，洗滌3次。步驟e中的工藝條件為室溫、時間為10分鐘，然后使用終止液終止反應，經酶標儀在波長450nm處讀取光密度值。步驟(3)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后15小時的Sp2/0細胞調整為9X 105/ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞。步驟(4)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第I分鐘滴加4. 5ml培養液；間隔2分鐘滴加5ml培養液，然后加培養液50ml，以HAT選擇培養基按36%的孔為I個細胞/孔進行細胞培養。步驟(5)中是將細胞培養至覆蓋10%孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，與多批次脂肪細胞分化代謝產物經ELISA篩選呈陽性表達。然后確定高分泌、高特異性細胞株擴大培養或凍存。步驟(6)中選用的BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將5X IO5雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去，在接種一周后有明顯的腹水產生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白純化儀FPLC將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，吸光單位=1. 44時濃度為lmg/ml。實施例2 :抗體芯片的制備方法在實施例I基礎上增加如下工藝步驟步驟(7)中選用的CY3標記補體C3抗體。步驟(8)中選用的脂肪細胞分化代謝產物芯片微陣列點樣(每張芯片包括4-8個陣列，I個標準，3-7個檢測)標準陣列檢測范圍O. 01 100ng/ml，檢測陣列45種抗體(每種抗體2個點)。實施例3 :本發明所述單抗各項指標檢測將實施例I篩選的IGF-I雜交瘤細胞株分泌的單抗進行序列分析，其重鏈可變區如下EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYIMffffVRQA PGKGLEffVSV ISSSGGMTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDN ⑶YVGEKGFD IffGQGTMVTV SSAA (如 SEQID No. I 所示)其輕鏈可變區如下QDIQMTQSPS SLSASV⑶RV TITCRASQSI SNYLNffYQQK PGKAPKLLIY TASTLQSGVPSRFSGSASGT DFTLTINSLQ PEDFATYSCQ QSYNSPffTFG QGTKVEIKRTS (如 SEQ ID No. 2 所示)實施例4 :指標檢測本發明實施例I制備的IGF-I單克隆抗體的各項指標如下I、陽性克隆孔腹水酶聯免疫吸附實驗效價大于I :560002、該芯片所包含的45種脂肪細胞分化代謝產物相關抗體如下 脂肪因子(adipokines):TNF_ a、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4、GLUT-4, LPL, PGAR、UCPs, PPAR- y、C/EBP、ADDl、SREBPl、NPY與疾病相關的因子MC-4R、P0MC、a-MSH、AgRP、orexin、GH、IGF_l、Acrp30、VEGF、HBEGF,HGF,Ang II、ACE、AGT、FA transporter, eNOS、iNOS各分化階段標志因子ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase>AP2、apoE、perilipin、ACBP>PEPCK> A2-adrenoreceptor 此脂肪細胞分化代謝產物抗體芯片經30批次的脂肪細胞分化代謝產物產品的特異性篩選表達均為陽性，與11種18批次的其它脂肪細胞分化代謝產物進行特異性篩選陽性表達為O。表明此芯片特異性很高，適合提供給醫療及科研機構進行脂肪細胞分化代謝產物的鑒定和質控評價，此抗體還可制成免疫組化或酶聯免疫吸附實驗試劑盒開展醫學基礎研究。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.IGF-I的單克隆抗體，其特征在于，其重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，其輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重鏈可變區由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，輕鏈可變區由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述單克隆抗體具有特異性結合IGF-I的特性。
2.根據權利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包括單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體、以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗原結合結構域的任何多肽。
3.權利要求I至2任一項所述的單克隆抗體在制備糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓、月巴胖的檢測試劑中的用途。
4.一種試劑，包含權利要求I至2任一項所述的單克隆抗體。
5.一種試劑盒，包含權利要求I至2任一項所述的單克隆抗體。
6.一種抗體芯片，包含權利要求I至2任一項所述的單克隆抗體。
7.根據權利要求6所述的抗體芯片，其特征在于，還包含特異性結合以下脂肪細胞分化代謝產物的抗體TNF- a、ASP、leptin、PAI-1、IL-6、resistin、adiponectin、visfatin、RBP-4、GLUT-4、LPL、PGAR、UCPs、PPAR-Y、C/EBP、ADDl、SREBPl、NPY、MC-4R、POMC、a-MSH、AgRP, orexin、GH、IGF-U Acrp30、VEGF, HBEGF, HGF, Ang II、ACE、AGT, FA transporter、eNOS、iNOS、ACC、FAS、ME、ATP-citratelyase、AP2、apoE、perilipin、ACBP、PEPCK、A2-腎上腺素能受體。
8.包含權利要求6或7所述抗體芯片的試劑盒，其特征在于，還包含信標分子標記的C3補體抗體，所述信標分子優選為CY3。
全文摘要
本發明涉及生物工程技術領域，公開了一種脂肪細胞分化代謝產物的IGF-1單克隆抗體及包含該抗體的芯片。本發明所述單克隆抗體重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明所述單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應結果便于質量控制，利于標準化和規范化。包含此抗體的芯片可直接應用于醫療及科研機構對心腦血管疾病、動脈硬化等疾病進行檢測和預防的研究，在臨床診斷領域中具有極高的應用價值，解決了傳統技術存在的費時、費力、結果重復性差等技術問題，用本發明所述芯片進行大眾人群的體檢和臨床診斷省時、省力、簡便、快速，具有廣泛的工業應用前景。
文檔編號G01N33/577GK102863530SQ20121036338
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者李彬 申請人:李彬