本發明涉及污水生物處理領域，提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮(NO)原位測定的方法。

背景技術：

生物脫氮過程包括硝化過程和反硝化過程，在生物反硝化過程中會產生NO中間產物。NO對微生物作用存在不同論斷，一方面NO是無色無味且難溶于水的有毒氣體，對微生物會有一定的毒害作用；但另一方面NO是真核生物體內重要的活性分子，在微生物體內也發揮著重要作用，例如在過氧化氫壓力下保護微生物細胞、提高微生物耐藥性等。關于脫氮微生物胞內NO對微生物作用的研究可能為脫氮型活性污泥的生理特性提供新的思路，因此對脫氮型微生物胞內NO的研究具有重要意義。

然而目前對NO的檢測技術還存在不足之處，尤其是對脫氮型活性污泥中不同種類微生物NO產生情況及對反硝化作用影響的技術相對缺乏，開發一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的方法來研究脫氮型活性污泥微生物在反硝化過程中的作用及不同種類微生物在此過程中的NO貢獻情況十分必要。

技術實現要素：

針對上述現象不足之處，本發明提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮(NO)原位測定的方法，該方法可以對所有脫氮型污泥進行微生物胞內NO的原位測定，以此來確定反硝化過程中NO變化情況及NO在不同微生物細胞中的分布情況，本方法為分析各菌群對反硝化功能分析提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的優化方案。

一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)、選取未膨脹的脫氮型污泥或已膨脹的脫氮型污泥作為目標污泥，分析其特征情況；

(2)、用1*PBS清洗目標泥三次，并用1*PBS稀釋至原本泥量，去除脫氮型污泥中其他雜質的干擾；

(3)、未膨脹的脫氮型污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的方案為：吸取步驟(2)1-10μL樣品均勻地涂在事先用明膠包被好的玻片上的每個well孔中，涂片量同樣以剛好平鋪實際玻片上well孔為準，并在室溫下晾干；在避光條件下，取1-20μL濃度為1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO熒光探針)添加到涂有樣品的每個well孔中，DAF-FM DA添加量以探針液包被住well孔中污泥；將樣品放置于20-37℃恒溫條件下靜置5-20分鐘后取出，在避光條件下用1*PBS洗滌玻片三次，將未進入微生物細胞的DAF-FM DA(NO熒光探針)液去除，并置于室溫下晾干，加入抗熒光衰減劑，并用指甲油密封，進行后續熒光原位檢測；

或已膨脹的脫氮型污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的方案為：在避光條件下，先將稀釋好的1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO熒光探針)與步驟(2)樣品等體積混合，混勻后置于0-4℃條件下靜置5-20分鐘，后再吸取1-10μL加有DAF-FM DA的樣品均勻平鋪涂在事先用明膠包被好的玻片每個well孔中(涂片量以剛好平鋪實際玻片上well孔為準)，并置于室溫下晾干，加入抗熒光衰減劑，并用指甲油密封，進行后續熒光原位檢測。

未膨脹的脫氮型污泥的SVI值小于150mL/g，已膨脹的脫氮型污泥的SVI值大于150mL/g。

DAF-FM DA的溶液優選為1*PBS。

該方法可以對正常的未膨脹污泥及膨脹脫氮型污泥都可以進行微生物胞內NO的原位測定，以此來確定反硝化過程中NO變化情況及NO在不同微生物細胞中的分布情況，本方法為分析各菌群對反硝化功能分析提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的優化方案。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

(1)本發明提供的一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮(NO)原位測定的方法，對正常的未膨脹污泥及膨脹污泥都可以進行微生物胞內NO的原位測定，以此來確定反硝化過程中NO變化情況及NO在不同微生物細胞中的分布情況。

(2)該發明提供的一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮(NO)原位測定的方法，和一氧化氮反應形成的熒光產物受pH值的影響小，其產生的熒光更加穩定，不容易淬滅且其檢測敏感度高。

(3)該發明提供的一種脫氮型活性污泥微生物胞內一氧化氮(NO)原位測定的方法，后期可以和膨脹污泥絲狀菌原位雜交試驗相結合，探究具體絲狀菌中對NO及反硝化作用的影響。

附圖說明

圖1(1a-1d)為本發明脫氮型無膨脹活性污泥微生物胞內一氧化氮熒光原位圖(1000倍)；

圖2(2a-2d)為本發明脫氮型膨脹活性污泥微生物胞內一氧化氮熒光原位圖(1000倍)。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方法對本發明作進一步詳細說明，但本發明并不限于以下實施例。

實施例1

1、選取實驗室中未膨脹的和已膨脹的脫氮型污泥作為目標污泥，將未膨脹脫氮型污泥標記為1號樣片，膨脹的脫氮型污泥標記為2號樣品；

2、分別分析1號和2號樣品的特征：1號和2號樣品的污泥濃度分別為3000mg/L和2500mg/L，SVI值分別為65mL/g和281mL/g，總氮去除率分別為55.3％和68.6％；

3、用1*PBS清洗目標泥三次，并用1*PBS稀釋至原本泥量，去除污泥中其他雜質的干擾；

4、將1號樣品混勻后均分為4份，分別標記為A、B、C和D樣品；

5、在避光條件下，將原有的DAF-FM DA(NO熒光探針)在20℃水浴溫育片刻至全部融解后，將其濃度稀釋為10μmol/L。

6、分別取1mL的A和B樣品置于5mL的離心管中，在避光條件下，添加等體積稀釋好的DAF-FM DA(NO熒光探針)，輕輕混勻。將A樣品置于4℃冰箱，B樣品放置于37℃恒溫箱中，靜置20分鐘后取出。

7、在避光條件下，用10μL槍頭分別吸取上過探針的A和B樣品均勻平鋪涂在事先用明膠包被好的玻片每個well孔中，涂片量以剛好平鋪實際玻片上well孔為準，本試驗涂片量為3-5μL，并在室溫下晾干；

8、用10μL槍頭分別吸取C和D樣品均勻的涂在事先用明膠包被好的玻片上的每個well孔中，涂片量同樣以剛好平鋪實際玻片上well孔為準，本試驗涂片量為3-5μL，并在室溫下晾干；

9、在避光條件下，分別取10μL DAF-FM DA(NO熒光探針)添加到涂有C和D樣品的每個well孔中，其添加量以探針液包被住well孔中污泥為宜，本試驗中添加量為10μL。將C樣品置于4℃冰箱，D樣品放置于37℃恒溫箱中，靜置20分鐘后取出。

10、在避光條件下將C和D樣品用1*PBS洗滌玻片三次，將未進入微生物細胞的DAF-FM DA(NO熒光探針)液去除，并置于室溫下晾干；

11、待A、B、C和D樣品都處理完畢后，分別對各樣品加入抗熒光衰減劑，并用指甲油密封，放置于熒光顯微鏡下進行觀察拍照，圖(1a-1d)分別對應未膨脹A、B、C和D樣品。

12、對不同條件下的NO顯微鏡照片進行比對分析，得出最優的脫氮型無膨脹活性污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的方案為：吸取3-5μL樣品均勻地涂在事先用明膠包被好的玻片上的每個well孔中，涂片量同樣以剛好平鋪實際玻片上well孔為準，并在室溫下晾干；在避光條件下，取10μL DAF-FM DA(NO熒光探針)添加到涂有樣品的每個well孔中，其添加量以探針液包被住well孔中污泥為宜。將樣品放置于37℃恒溫靜置20分鐘后取出后在避光條件下用1*PBS洗滌玻片三次，將未進入微生物細胞的DAF-FM DA(NO熒光探針)液去除，并置于室溫下晾干，熒光照片(圖1-d)顯示脫氮型微生物胞內NO分布均勻；

13、將2號樣品按照3-12的步驟進行分析，得出最優的脫氮型膨脹活性污泥微生物胞內一氧化氮原位測定的方案為：在避光條件下，先將稀釋好的10μmol/L的DAF-FM DA(NO熒光探針)與樣品等量混合，輕輕混勻后置于4℃條件下靜置20分鐘，后再吸取3-5μL樣品均勻平鋪涂在事先用明膠包被好的玻片每個well孔中(涂片量以剛好平鋪實際玻片上well孔為準)，并在室溫下晾干，熒光照片顯示即使在絲狀菌體內(圖2-a)也有NO產生并廣泛分布，其中圖(2a-2d)分別對應已膨脹A、B、C和D樣品。。

凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。