本發明涉及比色皿的改進，具體涉及一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法。

背景技術：

1989年，《科學》雜志報導Drake等人利用原子力顯微鏡(AFM)的接觸模式觀測云母片上的凝血酶催化血纖蛋白原的聚合反應時，觀察到了平行的彎曲纖維陣列【Science,1989,243,1586】。1990年，《Langmuir》雜志報導Lin等人利用原子力顯微鏡(AFM)的接觸模式觀測免疫球蛋白G(4-4-20 IgG2)在PBS緩沖液中的自組裝時，也發現了蛋白質沉積而成的褶皺結構，其脊部呈反復彎曲狀，但整體取向大致平行【Langmuir,1990,6,509】。然而，在這些試驗中，觀測者均未注意到探針對成纖的影響。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，該方法操作簡便，能夠精確控制生成的膠原蛋白納米纖維陣列結構的走向。

實現本發明目的的技術方案如下：

一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，具體步驟如下：

步驟1，將云母片固定在載玻片上，用膠帶撕開云母片表層使其露出新鮮晶面，清洗干凈；

步驟2，在云母片的新鮮晶面上滴加40～50μg/mL的膠原蛋白單體溶液，培育2～3小時，培育結束后清洗除去吸附不牢的膠原蛋白；

步驟3，將云母晶面用水浸潤，利用原子力顯微鏡對膠原蛋白進行加工，采用接觸模式，探針上施加的力為10^-8～10^-6N，得到設定取向的蛋白納米纖維陣列；

步驟4，將加工后的云母片粘結成比色皿。

發明人發現在原子力顯微鏡的接觸模式下，在探針上施加合適的力，膠原蛋白可以形成整體取向一致的纖維陣列，且與單體的自組裝能力無關。基于單根纖維的特性以及纖維陣列的取向與探針掃描方向的關系，發明人提出了原子力顯微鏡探針的掃把機理，即：在原子力顯微鏡的接觸模式下，樣品作用于探針上的力可分解成水平與垂直方向，其中垂直方向上的力會使懸臂發生彎曲。在掃描過程中，垂直方向的力或懸壁的彎曲度應保持恒定，這由壓電傳感器通過調節懸臂高度來控制。當作用在探針上的力大于樣品分子與基質的結合力時，探針將樣品分子推動，像掃把一樣掃動分子并堆積起來。此時探針受力和懸臂彎曲度都會增大，當垂直方向的力大過壓電傳感器設置的閾值時，系統便將懸臂上提以緩解壓力。于是，探針便滑過堆積的樣品分子表面。隨著垂直方向的力進一步減小，壓電傳動系統將探針再次放低來進行新一輪的掃把運動。這樣，每一行掃描結束后，探針會將樣品分子掃成幾堆。當接下來的一行掃描時，又會形成新的樣品分子堆積。如果行距合適使得相鄰兩行的樣品分子堆能相互接觸，它們便很可能隨機結合起來，形成了呈之字形的隨機反復彎曲的單根纖維，其大致取向垂直于探針的行掃描方向。

本發明中，在云母片表面的不同區域使用原子力顯微鏡的接觸模式來制造蛋白納米纖維時，在合適的探針作用力下才能產生纖維，當探針作用力遠大于吸附分子與基質或分子之間的作用力時，探針便可能將蛋白分子掃出掃描區域；纖維取向垂直于探針行掃描方向；單根纖維的尺寸由探針作用力和掃描行間距共同決定。本發明操作簡便，能夠精確控制生成的膠原蛋白納米纖維陣列結構走向，比色皿表面接觸角均值達到9.5°，具有良好的親水性能，可用于細胞培養。此外，本發明比色皿相對的兩個云母片上的蛋白納米纖維陣列可加工成統一方向，具有很好的偏振特性。若作為掩模，也可以結合電化學方法合成新型的生物傳感器。

附圖說明

圖1為原子力顯微鏡接觸模式下探針的掃把機理示意圖。

圖2為實施例1制得的去離子水覆蓋的云母晶面上的膠原蛋白膜層的原子力顯微鏡表面形貌圖。

圖3為實施例1制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列的原子力顯微鏡高度圖。

圖4為實施例1接觸模式下原子力顯微鏡探針在去離子水覆蓋的云母晶面的不同區域制造膠原蛋白纖維陣列。

圖5為實施例2制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列的原子力顯微鏡高度圖。

圖6為實施例2制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列的原子力顯微鏡高度圖。

圖7為實施例2云母晶面上的靜態接觸角，其中A為嶄新的(001)晶面，B為具有膠原蛋白納米纖維膜層覆蓋的晶面。

圖8為實施例2制得的膠原蛋白納米纖維陣列膜層的透射比測試圖。

圖9為實施例2具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的結構示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳述。

實施例1

一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，具體步驟如下：

步驟1，將云母片切割成約1cm×1cm的方片，用雙面膠貼在載玻片中央，用單面透明膠帶撕開云母片表層使露出新鮮晶面，用去離子水潤洗晶面兩次；

步驟2，取適量5mg/mL的膠原蛋白單體溶液，用去離子水稀釋至40μg/mL；

步驟3，立刻滴上40μg/mL的膠原蛋白單體溶液覆蓋云母晶面3小時，培育完成后除去云母晶面上的膠原蛋白單體溶液，并用去離子水小心清洗晶面2次以除去吸附不牢的蛋白質；

步驟4，用去離子水覆蓋云母晶面，進行膠原蛋白的原子力顯微鏡表征與加工試驗。原子力顯微鏡對膠原蛋白樣品進行表征工作模式設置為輕敲模式，行掃描方向平行于探針懸臂方向，振幅約100nm，驅動頻率約8kHz，接近探針懸臂在溶液中的共振頻率，加工工作模式為接觸模式，施加在探針上的力在10^-8到10^-6N之間，兩種掃描模式的分辨率均為256×256。

AFM對樣品進行表征和加工，圖2是具有代表性的5μm×5μm區域，其表面均方根粗糙度約為0.8nm，這種不均勻性可能是膠原蛋白單體的隨機覆蓋導致。然而在原子力顯微鏡的接觸模式下對同一區域進行兩次同樣的掃描，接著使用輕敲模式進行表征如圖1所示，在原子力顯微鏡的接觸模式下，樣品作用于探針上的力可分解成水平與垂直方向，其中垂直方向上的力會使懸臂發生彎曲。在掃描過程中，垂直方向的力或懸壁的彎曲度應保持恒定，這由壓電傳感器通過調節懸臂或樣品臺的高度來控制。當作用在探針上的力大于樣品分子與基質的結合力時，探針將樣品分子推動，像掃把一樣在圖B中掃動分子并堆積起來。此時探針受力和懸臂彎曲度都會增大，當垂直方向的力大過壓電傳感器設置的閾值時，系統便將懸臂上提以緩解壓力。于是，探針便如圖C所示滑過堆積的樣品分子表面。隨著垂直方向的力進一步減小，在圖D中壓電傳動系統將探針再次放低來進行新一輪的掃把運動。這樣，每一行掃描結束后，探針會將樣品分子掃成幾堆。當接下來的一行掃描時，又會形成新的樣品分子堆積。如果行距合適使得相鄰兩行的樣品分子堆能相互接觸，它們便很可能隨機結合起來，形成了呈之字形的隨機反復彎曲的單根纖維，其大致取向垂直于探針的行掃描方向。

AFM加工得到如圖3所示的膠原蛋白納米纖維陣列圖。接觸模式的行掃描方向平行于探針懸臂方向(圖中用白色箭頭標出)，探針作用力設置為1×10^-7N。圖3中單根膠原蛋白納米纖維呈反復彎曲狀，但整個納米纖維陣列的取向較為一致，大致垂直于接觸模式的探針行掃描方向。數據分析結果顯示，單根蛋白納米纖維的長度從幾百納米到幾微米不等，平均高度約2nm，寬度約150nm，陣列中納米纖維間距并不均勻，從互相接觸到幾百納米不等。接觸模式下的初次掃描可以均衡云母表面的蛋白單體分布，對同一區域進行兩次同樣的掃描便可以得到較穩定且排列規則的蛋白納米纖維陣列，兩次以上的掃描對單根納米纖維的局部排列有顯著改變，但對納米纖維陣列的整體形貌影響不大。

另選了一塊如圖4所示的10μm×10μm區域來制造蛋白納米纖維，圖中白色箭頭平行于探針懸臂。首先，在A區域(5μm×5μm)利用原子力顯微鏡的接觸模式連續掃描兩次，行掃描方向垂直于探針懸臂方向，探針作用力設置為2×10-7N。緊接著在B區域(2.5μm×2.5μm)使用同種模式、相同方向以及相同探針作用力進行兩次連續掃描。接下來，在C區域(5μm×5μm)利用接觸模式連續掃描兩次，行掃描方向平行于探針懸臂方向，探針作用力增加到5×10-7N。接著，在D區域(2.5μm×2.5μm)使用同種模式和相同方向進行兩次連續掃描，但是探針作用力增加到1×10-6N。最后，我們在原子力顯微鏡的輕敲模式下對整個區域進行表征，得到了圖4中分塊的膠原蛋白納米纖維陣列圖。很顯然，A區域和C區域的納米纖維陣列的取向互相大致垂直，均垂直于接觸模式下探針的行掃描方向。對比圖2、3，在圖4的A區域由于探針作用力增加，單根蛋白纖維的平均寬度增加到約270nm，而在B區域由于掃描行間距變小產生更大重疊區域，蛋白纖維變得稀疏和粗壯，單根蛋纖維高度約5nm，寬度約350nm。在C區域，由于探針作用力進一步增加，可能有大量蛋白分子被探針帶出該區域，纖維變得稀疏且單薄。在D區域，當探針的作用力較圖1增加了一個數量級時，膠原蛋白分子基本上被探針“掃”走了。

實施例2

一種利用原子力顯微鏡制備具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層比色皿的方法，具體步驟如下：

步驟1，將云母片切割成約1cm×1cm的方片，用雙面膠貼在載玻片中央，用單面透明膠帶撕開云母片表層使露出新鮮晶面，用去離子水潤洗晶面兩次；

步驟2，取適量5mg/mL的膠原蛋白單體溶液，用去離子水稀釋至50μg/mL；

步驟3，立刻滴上50μg/mL的膠原蛋白單體溶液覆蓋晶面2小時，然后除去云母晶面上的蛋白質溶液，并用去離子水小心清洗晶面2次以除去吸附不牢的蛋白質；

步驟4，用去離子水覆蓋云母晶面進行膠原蛋白的原子力顯微鏡表征與加工試驗，得到設定取向的蛋白納米纖維陣列。然后將云母片粘結成比色皿。

在去離子水覆蓋的云母片表面的不同區域使用原子力顯微鏡的接觸模式來制造蛋白納米纖維時，當其他條件一樣，僅掃描方向不同時，我們得到了如圖5、6所示的結果。圖5、6是兩個不同位置的2.5μm×2.5μm區域。兩區域均使用原子力顯微鏡的接觸模式連續掃描兩次，緊接著使用輕敲模式來進行表征(圖中白色箭頭為平行探針懸臂方向)；接觸模式的探針作用力均設置為1×10^-7N。在接觸模式下，圖5區域的行掃描方向為平行于探針懸臂方向，圖6的方向為垂直于探針懸臂方向。圖5、6中蛋白纖維密度較圖3稀疏，平均高度約3nm，寬度約200nm。盡管單根纖維呈反復彎曲狀，但整個纖維陣列的取向大致垂直于接觸模式下的行掃描方向。

分別對嶄新的和已有膠原蛋白納米纖維膜層覆蓋的云母晶面樣品進行靜態水滴接觸角的基線圓法測試，為減小測量誤差，我們對同一樣品取了3個點進行測量后取其平均值。結果如圖7所示。在圖7(A)中嶄新的云母晶面接觸角測量均值為25.8°，而圖7(B)有蛋白納米纖維覆蓋的晶面接觸角均值僅為9.5°。很顯然，膠原蛋白納米纖維膜層顯著地增強了云母晶面的親水性。

同時對膠原蛋白納米纖維膜層做透射分析，透射波長范圍為360-1100nm，結果如圖8所示。從透射圖可以看出，從400nm之后，透射比為80％以上，隨著波長的增大，透射比穩定在90％左右，說明此膜層具有良好的透光性能。

綜上所述，對制得的具有膠原蛋白納米纖維陣列膜層的比色皿在AFM和接觸角測試儀上進行性能表征，結果表明按照實例2的工藝參數，制得的膠原蛋白納米纖維陣列膜層的比色皿，如圖9所示，具有很好的線性排列特性、接觸角小、親水性好、細胞培養特性、生物傳感器特性。