一種紫菜蛋白抑菌肽的制備方法
【專利摘要】一種紫菜蛋白抑菌肽的制備方法，屬于天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域。本發(fā)明以條斑紫菜為原料，經(jīng)過烘干、粉碎等預(yù)處理后，將原料經(jīng)過超聲波破碎以及硫酸銨沉淀蛋白后，利用木瓜蛋白酶特定條件下酶解紫菜原料得到抑菌肽的粗品，該粗品經(jīng)過離子交換層析、G-25凝膠層析等色譜方法分離純化，得到紫菜蛋白抑菌肽。該紫菜蛋白抑菌肽分子量主要分布在1000Da以下，最適作用pH為6.5，熱穩(wěn)定性好；對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有效果，其中對(duì)革蘭氏陽性菌抑制效果更強(qiáng)，其抑菌效果主要是通過對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用達(dá)到的。該紫菜蛋白抑菌肽分子量小，抑菌活性較好，在制備抗菌性藥物、食品保鮮劑等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種紫菜蛋白抑菌肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋植物活性成分提取，具體涉及一種紫菜蛋白抑菌肽的制備方法，屬于天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著抗生素的濫用，自然界中具有抗藥性的微生物越來越多，2013在多個(gè)國家發(fā)現(xiàn)了曾出現(xiàn)在英國的超級(jí)細(xì)菌。上世紀(jì)90年代以來，由于全球性禽流感的蔓延，眾多科學(xué)家擔(dān)心家禽和各種動(dòng)物的耐藥性疾病會(huì)通過食物鏈傳染給人類，造成難易治愈的病患感染，人們開始關(guān)注高效安全的抑菌藥物。因?yàn)檠兄菩滦突瘜W(xué)合成的抗菌藥物需要周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、技術(shù)要求苛刻。所以目前很多醫(yī)藥公司開始把目光轉(zhuǎn)移到天然的抗菌藥物，抑菌肽具有抗菌廣譜性、抗病毒和腫瘤等活性，以及促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、促進(jìn)腸道對(duì)礦物質(zhì)的吸收、維持機(jī)體的生理平衡、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)活性。抑菌肽一般分子量很小、水溶性好、具有溫度穩(wěn)定性、PH穩(wěn)定性以及不易產(chǎn)生耐藥性和無溶血性等優(yōu)點(diǎn)，作為一種低毒和高效的新型抑菌藥、食品保鮮劑和保健品將會(huì)擁有廣闊的發(fā)展前景。
[0003]我國是紫菜資源生產(chǎn)加工及利用的大國，沿海的浙江、廣東、江蘇等省均有大面積種植，紫菜產(chǎn)量全球第一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國紫菜年產(chǎn)量約6萬噸，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷日本、東南亞以及歐美等國家和地區(qū)，但是目前國內(nèi)的產(chǎn)品主要是通過簡(jiǎn)單地干燥后加工成粗加工食品或產(chǎn)品附加值相對(duì)低的調(diào)味料。通常，每100克干紫菜中含有20%-45%的蛋白質(zhì)、20%-40.5%的碳水化合物、0.6%-2.1%的脂肪和大量的維生素等，其氨基酸種類齊全，具有抑菌活性、抗氧化性、降血壓、降血糖、增強(qiáng)免疫性等多種功能。可見紫菜是典型的高蛋白、高纖維、低脂肪的健康食品。紫菜中的蛋白質(zhì)含量是海帶的8.8倍，并且含有各種必需氨基酸，氨基酸指數(shù)高于大米、大豆、馬鈴薯等，說明紫菜屬于良好的蛋白質(zhì)來源，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供紫菜酶解產(chǎn)物中一種紫菜蛋白抑菌肽的制備方法，從天然產(chǎn)物中分離出一種紫菜蛋白抑菌肽，該方法操作簡(jiǎn)單、安全性高，成本低。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案，將紫菜烘干經(jīng)過粉碎后，采用超聲波輔助破碎紫菜細(xì)胞，采用硫酸銨鹽析法沉淀蛋白，然后采用酶解技術(shù)處理紫菜蛋白后，經(jīng)過離子交換層析、G-25凝膠層析等色譜方法分離純化，得到純度較高的紫菜蛋白抑菌肽。
[0006]通過色譜技術(shù)測(cè)定肽分子量分布情況；通過實(shí)驗(yàn)考察紫菜蛋白抑菌肽的熱穩(wěn)定性以及最佳作用PH ;采用電鏡觀察的方法考察紫菜蛋白抑菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌的作用機(jī)理；通過比較該抑菌肽與氨芐青霉素以及硫酸卡那霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性來反映紫菜蛋白抑菌肽的效價(jià)。
[0007]一種紫菜蛋白抑菌肽的制備方法，步驟為:
(I)紫菜蛋白的提取和酶解:
a、以條斑紫菜為原料，烘干后粉碎，過篩，取60-80目部分溶于0.02mol/L、pH 7.0的Na2HPO4-KH2POj^沖液中，溶解時(shí)紫菜與緩沖液料液質(zhì)量體積比為1:25 ;
在冰浴條件下用350 W功率的超聲波處理15 min，處理時(shí)以工作3 S，間隔3 s為一個(gè)循環(huán)；將超聲處理后的物料以4000 r/min的速度離心15 min,去沉淀,取上清液,添加硫酸銨至60%飽和度，通過鹽析提取，離心收集固體物目的紫菜蛋白；
b、將步驟a中硫酸銨鹽析得到的紫菜蛋白按濕重計(jì)，以紫菜蛋白與緩沖液料液質(zhì)量體積比為1:10加入？?jī)?cè).5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，木瓜蛋白酶加入量為4000 U/g濕重計(jì)紫菜蛋白，充分混合均勻后65°C酶解4 h，反應(yīng)過程中保持pH的穩(wěn)定；酶解結(jié)束后，煮沸滅酶15 min，靜置冷卻后以10000 r/min的速度離心15 min，棄去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液；
(2)紫菜蛋白抑菌肽的純化制備:
c、DEAE-52陰離子交換層析:采用階段洗脫的方法，流動(dòng)相:0-74min用10mmol/mL的平衡液洗脫，平衡液為PH6.8的Na2HPO4-檸檬酸溶液，74-120 min用含有0.2mol/mL的NaCl溶液洗脫，120-200 min用含有0.4mol/mL的NaCl溶液洗脫，200_250min用含有0.6mol/mL的NaCl的溶液洗脫；流速均為I mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm ；
收集各峰組分，并對(duì)收集的各峰組分濃縮至紫菜蛋白抑菌肽濃度為6mg/mL后進(jìn)行抑菌活性比較，取抑菌活性較好的離子交換層析峰組分冷凍干燥備用；
d、SephadexG_25凝膠層析:取上述步驟c冷凍干燥的抑菌活性較好的離子交換層析峰組分溶解在超純水中，濃度為0.lmg/mL ;采用Sephadex G_25凝膠層析柱經(jīng)超純水平衡后，進(jìn)樣量2mL，用超純水進(jìn)行洗脫；
檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm,流速:0.5mL/min, 80min后不再出峰,收集各峰組分，并對(duì)各峰組分濃縮至紫菜蛋白抑菌肽濃度為6mg/mL后進(jìn)行抑制劑活性比較，取抑菌活性較好的凝膠層析峰組分冷凍干燥，即得產(chǎn)品紫菜蛋白抑菌肽。
`[0008]制備的紫菜蛋白抑菌肽的應(yīng)用:所述紫菜蛋白抑菌肽的最適pH為6.5，最小抑菌濃度為 0.25mg/mL。
[0009]紫菜蛋白抑菌肽特性分析鑒定:
I)、肽分子量分布:將細(xì)胞色素(MW1250)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW451 )、桿菌酶(MW1450)、乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(MW189)標(biāo)準(zhǔn)品用0.22 μ m微孔濾膜處理后，經(jīng)過以下色譜條件上樣:色譜柱TSKgel 2000 Sffxl (300 mmX 7.8 mm, 5 μ m);柱溫30°C,流動(dòng)相:水:三氯乙酸:乙腈=550:450:1 (V:V:V);流速為I mL/min，進(jìn)樣量為5 μ L，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，根據(jù)出峰圖繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線；取紫菜蛋白酶解液5mL與10%的三氯乙酸(TCA) 5mL混合均勻，放置桌面靜止IOmin, 8000r/min離心10min,上清液用0.22 μ m微孔濾膜處理，相同色譜條件下上樣測(cè)量抑菌肽的分子量分布。結(jié)果表明紫菜蛋白酶解液中分子量主要分布在1000Da以下的肽占96.68%。
[0010]2)、最適pH與熱穩(wěn)定性:
將純化的紫菜蛋白抑菌肽溶于水中(濃度為0.1 mg/mL)并調(diào)節(jié)至不同的pH值，同時(shí)用對(duì)應(yīng)PH的0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液做對(duì)照，經(jīng)0.22 μ m膜過濾除菌后，測(cè)定紫菜蛋白抑菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性，觀察抑菌圈直徑，結(jié)果表明抑菌肽最適作用pH 為 6.5。
[0011]將純化的紫菜蛋白抑菌肽經(jīng)沸水浴處理不同時(shí)間后立即水浴待冷卻到室溫再檢測(cè)其抑菌活性，結(jié)果表明紫菜蛋白抑菌肽沸水處理過程中其抑菌活性基本不受影響，沸水處理Ih后抑菌活性仍然保持在90%左右，這說明紫菜蛋白抑菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性。
[0012]3)、抑菌機(jī)理:以不添加抑菌肽的金黃色葡萄球菌為空白對(duì)照組，添加抑菌肽的金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)組，比較兩組菌的電鏡圖發(fā)現(xiàn)空白組的金黃色葡萄球菌正常生長(zhǎng)，而實(shí)驗(yàn)組的金黃色葡萄球菌在7h后細(xì)胞膜變得模糊和破裂，部分細(xì)胞質(zhì)流出細(xì)胞外。由此可以得知，該抑菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果主要是通過對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用達(dá)到的。
[0013]4)、最小抑制濃度與效價(jià)分析:
A液:取98mL的牛肉膏培養(yǎng)基，加入ImL的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液，ImL活化的金黃色葡萄球菌(108cfu/mL);B液:取98mL的牛肉膏培養(yǎng)基，加入ImL的TTC溶液，ImL滅菌的生理鹽水。
[0014]取36個(gè)滅菌的試管分成三組每組12個(gè)，其中1-11號(hào)每管加入2.5mL的A液，再往I號(hào)試管加入2.5mL的過濾除菌的紫菜抑菌肽樣品(2mg/mL)，混合均勻后從I號(hào)中取出
2.5mL加入2號(hào)試管中混合均勻,接著從2號(hào)試管中去2.5mL加入到3號(hào)試管中混勻,依次稀釋直到10號(hào)試管，并將10號(hào)試管中多余的2.5mL液體棄去。11號(hào)做陽性對(duì)照，而12號(hào)試管中加入2.5mL的B液做陰性對(duì)照。37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液顏色變化，無色試管中樣品的最低濃度即為該樣品的最小抑制濃度。觀察發(fā)現(xiàn)4號(hào)試管開始出現(xiàn)微紅色，表明菌體開始生長(zhǎng)，通過計(jì)算可以得出紫菜蛋白抑菌肽的最小抑菌濃度為0.25mg/mL。
[0015]采用已知效價(jià)的氨芐青霉素和硫酸卡那霉素作為樣品的陽性對(duì)照，分別配制成不同濃度的抗生素溶液，過濾除菌后與2mg/mL的紫菜蛋白抑菌肽同時(shí)進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，比較各自形成抑菌圈直徑的大小。結(jié)果表明2mg/mL抑菌肽形成的抑菌圈直徑與分別用36 μ g/mL氨節(jié)青霉素和100 μ g/mL硫酸卡那霉素形成的抑菌圈直徑大小一樣。
[0016]本發(fā)明的有益效果:以條斑紫菜為原料，采用超聲波輔助酶解的方式對(duì)紫菜中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，生成短肽和游離氨基酸后，依次通過離子交換層析、G-25凝膠層析色譜方法分離純化，富集濃縮凍干得到紫菜蛋白抑菌肽。該抑菌肽分子量小，抑菌活性較好，在制備抗菌性藥物、食品保鮮劑等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明提取紫菜蛋白抑菌肽的工藝流程圖。
[0018]圖2是用不同蛋白酶水解紫菜蛋白后產(chǎn)物的抑菌效果。1、胃蛋白酶；2、胰蛋白酶；
3、酸性蛋白酶；4、中性蛋白酶；5、堿性蛋白酶；6、木瓜蛋白酶；7、未加酶水解。圖中各點(diǎn)光圈越大表明產(chǎn)物的抑菌活性越好，該圖表明幾種酶中，木瓜蛋白酶酶解紫菜產(chǎn)物的抑菌活性最好，因此選用木瓜蛋白酶作為研究用酶。
[0019]圖3是紫菜蛋白酶解液肽分子量分布。
[0020]圖4是pH對(duì)紫菜蛋白抑菌肽抑菌活性的影響。
[0021]圖5是沸水浴 對(duì)紫菜蛋白抑菌肽抑菌活性的影響。
[0022]圖6是紫菜蛋白抑菌肽未作用時(shí)金黃色葡萄球菌的電鏡圖。
[0023]圖7是紫菜蛋白抑菌肽作用于金黃色葡萄球菌的電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】[0024]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0025]實(shí)施例1紫菜蛋白的制備和酶解:
取胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶分別水解紫菜蛋白，并與未水解的樣本做對(duì)比，結(jié)果如圖2所示。幾種酶中，木瓜蛋白酶酶解紫菜產(chǎn)物的抑菌活性最好，因此選用木瓜蛋白酶作為研究用酶。
[0026]a、以條斑紫菜為原料，烘干后粉碎，過篩，取60-80目部分溶于質(zhì)量體積比為1:25的Na2HPO4-KH2PO4 (0.02mol/L,pH 7.0)緩沖液中，在冰浴條件下用350 W功率的超聲波破碎15 min (工作方式為:工作時(shí)間3 S，時(shí)間間隔為3 S)，將超聲處理后的物料離心(4000r/min, 15 min)后棄去沉淀,對(duì)上清液添加硫酸銨至60%飽和度提取目的紫菜蛋白； b、將硫酸銨鹽析得到的紫菜蛋白以質(zhì)量(濕重)體積比1:10加入？?jī)?cè).5的Na2HPO4-KH2POJ^沖液，木瓜蛋白酶加入量為E/S=4000 U/g,充分混合均勻后65°C酶解4 h，反應(yīng)過程中保持pH的穩(wěn)定；酶解結(jié)束后，煮沸滅酶15 min，靜置冷卻后離心(10000 r/min,15 min)，棄去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液。
[0027]實(shí)施例2紫菜蛋白抑菌肽的純化制備:
a、DEAE-52陰離子交換層析:采用階段洗脫的方法，流動(dòng)相:(T74 min用10 mmol/mL的平衡液(PH6.8的Na2HPO4-檸檬酸)洗脫，74~120 min用含有0.2 mol/mL的NaCl洗脫，120~200 min 用含有 0.4 mol/mL 的 NaCl 洗脫，200~250 min 用含有 0.6 mol/mL 的 NaCl 的緩沖液洗脫，流速:1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm,收集各峰組分,并對(duì)收集的各峰組分濃縮后(6 mg/mL)進(jìn)行抑菌活性比較，取抑菌活性較好的峰組分冷凍干燥備用。
[0028]b、Sephadex G_25凝膠層析:取上述冷凍干燥的樣品溶解在超純水中，濃度為0.1mg/mL。S印hadex G-25凝膠層析柱經(jīng)超純水平衡后，進(jìn)樣量2 mL，用超純水進(jìn)行洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm,流速:0.5 mL/min, 80min后不再出峰,收集各峰組分,并對(duì)各峰組分濃縮后(6 mg/mL)進(jìn)行抑制劑活性比較，取抑菌活性較好的峰組分冷凍干燥備用。
[0029]實(shí)施例3紫菜蛋白抑菌肽的分子量分布
將細(xì)胞色素(麗1250)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、桿菌酶(麗1450)、乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(麗189)標(biāo)準(zhǔn)品用0.22 μ m微孔濾膜處理后，經(jīng)過以下色譜條件上樣:色譜柱 TSKgel 2000 Sffxl (300 mmX7.8 mm，5ym);柱溫 30 °C，流動(dòng)相:水:三氯乙酸:乙腈=550:450:1 (V:V:V);流速為I mL/min，進(jìn)樣量為5 μ L，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，根據(jù)出峰圖繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線；取紫菜蛋白酶解液5mL與10%的三氯乙酸(TCA)5mL混合均勻，放置桌面靜止10 min, 8000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μ m微孔濾膜處理，相同色譜條件下上樣測(cè)量抑菌肽的分子量分布。紫菜蛋白酶解液肽分子量分布如圖3所不，由圖可知紫菜蛋白酶解液中分子量分布在1000Da以下的肽占96.68%。
[0030]實(shí)施例4紫菜蛋白抑菌肽最適pH
將純化的紫菜蛋白抑菌肽溶于水中(濃度為0.lmg/mL)并調(diào)節(jié)至不同的pH值，同時(shí)用對(duì)應(yīng)PH的0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液做對(duì)照，經(jīng)0.22 μ m膜過濾除菌后，測(cè)定紫菜蛋白抑菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性，觀察抑菌圈直徑，PH對(duì)抑菌活性的影響圖如圖4所不,結(jié)果表明抑菌肽最適作用pH為6.5。
[0031]實(shí)施例5紫菜蛋白抑菌肽的熱穩(wěn)定性
將純化的紫菜蛋白抑菌肽經(jīng)沸水浴處理不同時(shí)間后立即水浴待冷卻到室溫再檢測(cè)其抑菌活性，沸水浴對(duì)紫菜蛋白抑菌肽抑菌活性的影響如圖5所示。結(jié)果表明紫菜蛋白抑菌肽沸水處理過程中其抑菌活性基本不受影響，I h后抑菌活性仍然保持在90%左右，這說明紫菜蛋白抑菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性。
[0032]實(shí)施例6紫菜蛋白抑菌肽的抑制機(jī)理
以不添加抑菌肽的金黃色葡萄球菌為空白對(duì)照組，添加抑菌肽的金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)組，比較兩組菌的電鏡圖發(fā)現(xiàn)空白組的金黃色葡萄球菌正常生長(zhǎng)，如圖6所示，而實(shí)驗(yàn)組的金黃色葡萄球菌在7 h后細(xì)胞膜變得模糊和破裂，如圖7所示，部分細(xì)胞質(zhì)流出細(xì)胞外。由此可以得知，該抑菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果主要是通過對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用達(dá)到的。
[0033]實(shí)施例7紫菜蛋白抑菌肽的最小抑制濃度與效價(jià)分析:
A液:取98 mL的牛肉膏培養(yǎng)基，加入I mL的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液，I mL活化的金黃色葡萄球菌(108 cfu/mL) ；B液:取98 mL的牛肉膏培養(yǎng)基，加入I mL的TTC溶液，I mL滅菌的生理鹽水。
[0034]取36個(gè)滅菌的試管分成三組每組12個(gè)，其中1-11號(hào)每管加入2.5 mL的A液，再往I號(hào)試管加入2.5 mL的過濾除菌的紫菜蛋白抑菌肽樣品(2 mg/mL)，混合均勻后從I號(hào)中取出2.5 mL加入2號(hào)試管中混合均勻,接著從2號(hào)試管中去2.5 mL加入到3號(hào)試管中混勻，依次稀釋直到10號(hào)試管，并將10號(hào)試管中多余的2.5 mL液體棄去。11號(hào)做陽性對(duì)照，而12號(hào)試管中加入2.5 mL的B液做陰性對(duì)照。37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液顏色變化，無色試管中樣品的最低濃度即為該樣品的最小抑制濃度。觀察發(fā)現(xiàn)4號(hào)試管開始出現(xiàn)微紅色，表明菌體開始生長(zhǎng)，通過計(jì)算可以得出紫菜蛋白抑菌肽的最小抑菌濃度為0.25mg/mL。`
[0035]采用已知效價(jià)的氨芐青霉素和硫酸卡那霉素作為樣品的陽性對(duì)照，分別配制成不同濃度的抗生素溶液，過濾除菌后與2 mg/mL的紫菜蛋白抑菌肽同時(shí)進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，比較各自形成抑菌圈直徑的大小。結(jié)果表明2 mg/mL紫菜蛋白抑菌肽形成的抑菌圈直徑與分別用36 μ g/mL氨節(jié)青霉素和100 μ g/mL硫酸卡那霉素形成的抑菌圈直徑大小一樣。
【權(quán)利要求】
1.一種紫菜蛋白抑菌肽的制備方法，其特征在于步驟為: (1)紫菜蛋白的提取和酶解: a、以條斑紫菜為原料，烘干后粉碎，過篩，取60-80目部分溶于0.02mol/L、pH 7.0的Na2HPO4-KH2POj^沖液中，溶解時(shí)紫菜與緩沖液料液質(zhì)量體積比為1:25 ; 在冰浴條件下用350 W功率的超聲波處理15 min，處理時(shí)以工作3 S，間隔3 s為一個(gè)循環(huán)；將超聲處理后的物料以4000 r/min的速度離心15 min,去沉淀,取上清液,添加硫酸銨至60%飽和度，通過鹽析提取，離心收集固體物紫菜蛋白； b、將步驟a中硫酸銨鹽析得到的紫菜蛋白按濕重計(jì)，以紫菜蛋白與緩沖液料液質(zhì)量體積比為1:10加入？?jī)?cè).5的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，木瓜蛋白酶加入量為4000 U/g濕重計(jì)紫菜蛋白，充分混合均勻后65°C酶解4 h，反應(yīng)過程中保持pH的穩(wěn)定；酶解結(jié)束后，煮沸滅酶15 min，靜置冷卻后以10000 r/min的速度離心15 min，棄去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液； (2)紫菜蛋白抑菌肽的純化制備: c、DEAE-52陰離子交換層析:采用階段洗脫的方法，流動(dòng)相:0-74min用10mmol/mL的平衡液洗脫，平衡液為PH6.8的Na2HPO4-檸檬酸溶液，74-120 min用含有0.2mol/mL的NaCl溶液洗脫，120-200 min用含有0.4mol/mL的NaCl溶液洗脫，200_250min用含有0.6mol/mL的NaCl的溶液洗脫；流速均為I mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm ； 收集各峰組分，并對(duì)收集的各峰組分濃縮至紫菜蛋白抑菌肽濃度為6mg/mL后進(jìn)行抑菌活性比較，取抑菌活性較好的離子交換層析峰組分冷凍干燥備用； d、SephadexG_`25凝膠層析:取上述步驟c冷凍干燥的抑菌活性較好的離子交換層析峰組分溶解在超純水中，濃度為0.lmg/mL ;采用Sephadex G_25凝膠層析柱經(jīng)超純水平衡后，進(jìn)樣量2mL，用超純水進(jìn)行洗脫； 檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm,流速:0.5mL/min,80min后不再出峰,收集各峰組分，并對(duì)各峰組分濃縮至紫菜蛋白抑菌肽濃度為6mg/mL后進(jìn)行抑制劑活性比較，取抑菌活性較好的凝膠層析峰組分冷凍干燥，即得產(chǎn)品紫菜蛋白抑菌肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的紫菜蛋白抑菌肽的應(yīng)用，其特征在于:所述紫菜蛋白抑菌肽的最適pH為6.5,最小抑菌濃度為0.25mg/mL。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103865973SQ201410131251
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】田亞平, 劉冬冬, 周鋒 申請(qǐng)人:江南大學(xué)