一種血必凈中間體多指標成分的含量測定方法與流程
本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種血必凈中間體中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量的檢測分析方法。
背景技術：
血必凈注射液為棕黃色至棕紅色的澄明液體，主要成分為紅花、川芎、丹參和當歸等，功能主治為化瘀解毒，用于溫熱類疾病見發熱、喘促、心悸、煩燥等瘀毒互結癥。隨著臨床研究的不斷深入，其應用范圍也在不斷拓寬，可用于腎臟、肺部、心血管、膿毒血癥、彌漫性血管內凝血(DIC)、多器官功能障礙綜合征(MDOS)、重癥急性胰腺炎、糖尿病酮癥酸中毒(DKA)等疾病。
血必凈注射液包含紅花、赤芍、川芎、當歸、丹參五味中藥材成分，由各藥材飲片經適當的工藝加工，制成紅花提取物、川丹當提取物、赤芍提取物，提取物經混合工序，制得血必凈中間體，再配以其他輔料，經多步生產工序，最終制成血必凈注射液。
血必凈中間體作為制劑生產的中間環節，其質量監控一直是制劑生產的關鍵環節，而其中功效成分的監控既能表征工藝的穩定性，更是中間體質量優劣的直接反映。
血必凈中間體包含三種功效成分——羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸，目前三種成分分別采用三種不同的液相色譜條件進行定性定量檢測，功效成分含量測定無法同步進行，試劑、耗材費用消耗大、人工占用時間長、檢測周期長。
本發明所建立的分析方法采用同一個液相色譜條件，通過相對校正因子的測定，以“一測多評”方法同時測定血必凈中間體中所含羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量，經與原方法結果比對，準確度與精密度相當，但克服了原方法檢測周期長、試劑耗材費用高等弊端，節約了試劑、耗材、人工成本，縮短了檢測周期，能更為有效地控制產品質量。
技術實現要素：
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種快速、準確地測定血必凈中間體多指標成分含量，且更加節省試劑耗材費用，節約人工成本的檢測方法。
本發明所述的血必凈中間體功效成分含量檢測方法，包括以下步驟：
(1)以芍藥苷為內參物的相對校正因子的測定
a、標準溶液的制備：
分別精密稱取羥基紅花黃色素A對照品、芍藥苷對照品、阿魏酸對照品、苯甲酸對照品適量，置V1體積容量瓶中，以50％甲醇水溶液為溶劑，溶解并定容至刻度，制得含羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸一定濃度的對照品混標濃溶液；將混標濃溶液進行七步梯度稀釋，使得各步稀釋后的標準溶液中各成分濃度分別在供試品限度濃度的40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％。
b、各組分校正因子計算：
采用兩臺不同高效液相色譜儀，取步驟a中制得的7個不同濃度的標準溶液按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。分別以各成分相對應的濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，繪制標準曲線。將羥基紅花黃色素A、阿魏酸、苯甲酸標準曲線的斜率分別除以芍藥苷標準曲線的斜率，即為各成分相對芍藥苷的校正因子。
(2)按校正因子法(一測多評法)測定供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、對照品工作溶液制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，置V2體積容量瓶中，以50％甲醇水溶液為溶劑，制得含芍藥苷CR的對照品工作溶液。
b、供試品溶液制備：精密移取體積V3為供試品，置體積為V4的容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，取體積為V5的此溶液，置體積為V6的容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
c、測定方法：分別精密量取體積為V7對照品混標工作溶液、供試品溶液，分別注入液相色譜儀，按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。根據步驟(2)中確定的校正因子，按下述公式計算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供試品中各成分的含量，mg/ml
CR——對照品工作溶液中芍藥苷濃度，mg/ml
AR——對照品工作溶液中芍藥苷峰面積
AX——供試品溶液中各成分峰面積
F——各成分相對芍藥苷的校正因子
(3)液相色譜條件：照高效液液色譜法測定，
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱，
流動相：以甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)體積比：(10：90-30：70)，
流速：0.8-1.2ml/min，
柱溫：30℃，
檢測波長：230nm，
進樣量：20μl，
運行時間：60min。
本發明采用一個色譜條件，只需配制一個成分的對照品溶液，根據已確定的校正因子，即可測定出供試品中其他三種成分的準確含量，節省了其他對照品的使用以及液相檢測過程中有機試劑的消耗，縮短了樣品的檢驗周期，既提高了工作效率又節約了成本。
本發明檢測方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下：
實驗一：方法精密度實驗
精密稱取芍藥苷對照品適量，以50％甲醇水溶液為溶劑，制得含芍藥苷0.4mg/ml的對照品工作溶液。精密移取供試品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按上述方法平行制備6份供試品溶液。精密量取對照品混標工作溶液、供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，按已確定的色譜條件進樣，記錄色譜圖。根據已確定的各成分相對芍藥苷的相對校正因子，按校正因子法計算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量。6份供試品溶液羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量測定結果的相對標準偏差應小于5.0％。試驗結果見下表：
表1對照品溶液響應因子測試結果
表2羥基紅花黃色素A含量測定重復性試驗結果(試驗人員A)
表3芍藥苷含量測定重復性試驗結果
表4阿魏酸含量測定重復性試驗結果
表5苯甲酸含量測定重復性試驗結果
結論：由上表可知，6份供試品溶液羥基紅花黃色素A測定結果的相對標準偏差為2.3％，芍藥苷測定結果的相對標準偏差為1.8％、阿魏酸測定結果的相對標準偏差為1.0％，苯甲酸含量測定結果的相對標準標準偏差為2.0％，小于規定的5.0％，重復性符合驗證要求。
實驗二：方法準確度實驗
回收率樣品溶液1的制備：取已知羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸濃度的血必凈中間體0.5ml，置10ml量瓶中，分別加入1.6mg/ml羥基紅花黃色素A對照品溶液、8.0mg/ml芍藥苷對照品溶液、0.16mg/ml阿魏酸對照品溶液、0.16mg/ml苯甲酸對照品溶液各0.5ml，加50％甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，作為回收率樣品溶液1，按上述方法平行制備3份。
回收率樣品溶液2的制備：取已知羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸濃度的血必凈中間體0.5ml，置10ml量瓶中，分別加入2.0mg/ml羥基紅花黃色素A對照品溶液、1.2mg/ml芍藥苷對照品溶液、0.2mg/ml阿魏酸對照品溶液、0.2mg/ml苯甲酸對照品溶液各0.5ml，加50％甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，作為回收率樣品溶液2，按上述方法平行制備3份。
回收率樣品溶液3的制備：取已知羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸濃度的血必凈中間體0.5ml，置10ml量瓶中，分別加入2.5mg/ml羥基紅花黃色素A對照品溶液、1.3mg/ml芍藥苷對照品溶液、0.25mg/ml阿魏酸對照品溶液、0.25mg/ml苯甲酸對照品溶液各0.5ml，加50％甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，作為回收率樣品溶液3，按上述方法平行制備3份。
將這9份回收率樣品溶液按精密度實驗測定方法進行測定，計算測定結果的回收率和相對標準偏差。要求回收率應在90.0％-110.0％之間，結果的相對標準偏差應小于5.0％。計算公式如下：
公式一：
公式二：
式中：CR——對照品溶液的濃度，μg/ml
AR——對照品溶液中主成分峰面積
AX——供試品溶液中各成分的峰面積
F——各成分相對芍藥苷的校正因子(羥基紅花黃色素A1.28，阿魏酸2.46，苯甲酸4.03)
CX——回收率樣品溶液中各成分濃度，μg/ml
C1——配制回收率樣品溶液所用的相應對照品溶液濃度，μg/ml
C2——血必凈中間體中各成分的濃度，μg/ml
試驗結果見下表：
表6對照品溶液響應因子試驗結果
表7羥基紅花黃色素A含量測定準確度試驗結果
表8芍藥苷含量測定準確度試驗結果
表9阿魏酸含量測定準確度試驗結果
表10苯甲酸含量測定準確度試驗結果
結論：由上表可知，9份樣品的回收率均在90.0％-110.0％之間，羥基紅花黃色素A測定結果的RSD為2.0％，芍藥苷測定結果的RSD為3.0％，阿魏酸測定結果的RSD為3.5％，苯甲酸測定結果的RSD為2.7％，各成分結果的相對標準偏差均小于規定的5.0％，準確度測定結果符合驗證要求。
實驗三：待測溶液穩定性實驗
按本發明已確定的含量測定方法制備對照品溶液及供試品溶液，將供試品溶液在室溫下放置0天、2天、4天后取樣，按給定色譜條件進樣，以芍藥苷為基準物按相對校正因子法計算各成分含量，各時間點羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量測定結果的相對標準偏差應小于5.0％。試驗結果見下表：
表11羥基紅花黃色素A含量測定溶液穩定性試驗結果
表12芍藥苷含量測定溶液穩定性試驗結果
表13阿魏酸含量測定溶液穩定性試驗結果
表14苯甲酸含量測定溶液穩定性試驗結果
結論：由上表可知，供試品溶液在室溫下放置0天、2天、4天后，各成分含量測定結果的相對平均偏差分別為：羥基紅花黃色素A為2.6％，芍藥苷為1.6％，阿魏酸為2.6％，苯甲酸為3.0％，小于規定的5.0％，符合驗證要求。
附圖說明
附圖1：對照品混合溶液典型圖譜
附圖2：實施例1供試品溶液檢測結果典型圖譜，出峰順序：羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸
附圖3：實施例2供試品溶液檢測結果典型圖譜，出峰順序：羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸
附圖4：實施例3供試品溶液檢測結果典型圖譜，出峰順序：羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明：
實施例1
本發明所述的血必凈中間體功效成分含量檢測方法，包括以下步驟：
(1)液相色譜條件：
照高效液液色譜法測定：
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠；
流動相：甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)(20：80)；
流速：1.0ml/min；
柱溫：30℃；
檢測波長：230nm；
進樣量：20μl；
運行時間：60min，
(2)以芍藥苷為內參物的相對校正因子的測定：
a、標準曲線溶液的制備：
羥基紅花黃色素A標準曲線溶液制備：取羥基紅花黃色素A對照品約20mg、精密稱定，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含羥基紅花黃色素A約2.0mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羥基紅花黃色素A的標準曲線溶液；
芍藥苷標準曲線溶液制備：取芍藥苷對照品約200mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含芍藥苷約2.0mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml芍藥苷的標準曲線溶液；
阿魏酸標準曲線溶液制備：取阿魏酸對照品約10mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含阿魏酸約0.1mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml阿魏酸的標準曲線溶液；
苯甲酸標準曲線溶液制備：取苯甲酸對照品約10mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含苯甲酸約0.1mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml苯甲酸的標準曲線溶液；
b、采用兩臺不同高效液相色譜儀，取步驟a中制得的7個不同濃度的標準曲線溶液按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。分別以各成分相對應的濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，繪制標準曲線，結果見表15—表22；將羥基紅花黃色素A、阿魏酸、苯甲酸標準曲線的斜率分別除以芍藥苷標準曲線的斜率，即為各成分相對芍藥苷的校正因子，結果見表23。
表15羥基紅花黃色素A標準曲線制備試驗結果(儀器1)
表16羥基紅花黃色素A標準曲線制備試驗結果(儀器2)
表17芍藥苷標準曲線制備試驗結果(儀器1)
表18芍藥苷標準曲線制備試驗結果(儀器2)
表19阿魏酸標準曲線制備試驗結果(儀器1)
表20阿魏酸標準曲線制備試驗結果(儀器2)
表21苯甲酸標準曲線制備試驗結果(儀器1)
表22苯甲酸標準曲線制備試驗結果(儀器2)
表23各成分以芍藥苷為內參物的校正因子測定結果匯總
(3)按校正因子法(一測多評法)測定供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、對照品工作溶液制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，以50％甲醇水溶液為溶劑，制得含芍藥苷0.4mg/ml的對照品工作溶液。
b、供試品溶液制備：精密移取供試品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
c、測定方法：精密量取對照品混標工作溶液、供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。根據步驟(2)中確定的校正因子，按下述公式計算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供試品中各成分的含量，mg/ml
CR——對照品工作溶液中芍藥苷濃度，mg/ml
AR——對照品工作溶液中芍藥苷峰面積
AX——供試品溶液中各成分峰面積
F——各成分相對芍藥苷的校正因子
結論：
1、校正因子確定后，進行血必凈中間體羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸含量測定時，則無需采用三種不同的液相條件，分別配制對照品溶液，僅需配制一份供試品溶液，一份單一成分的對照品溶液，即可完成中間體中四種成分的含量測定，簡化了試驗步驟，克服了原方法的弊端。
實施例2
本發明所述的血必凈中間體功效成分含量檢測方法，包括以下步驟：
(1)液相色譜條件：
照高效液液色譜法測定：
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠；
流動相：甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)(10：90)；
流速：0.8ml/min；
柱溫：30℃；
檢測波長：230nm；
進樣量：20μl；
運行時間：60min，
(2)以芍藥苷為內參物的相對校正因子的測定：
a、標準曲線溶液的制備：
羥基紅花黃色素A標準曲線溶液制備：取羥基紅花黃色素A對照品約20mg、精密稱定，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含羥基紅花黃色素A約2.0mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羥基紅花黃色素A的標準曲線溶液；
芍藥苷標準曲線溶液制備：取芍藥苷對照品約200mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含芍藥苷約2.0mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml芍藥苷的標準曲線溶液；
阿魏酸標準曲線溶液制備：取阿魏酸對照品約10mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含阿魏酸約0.1mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml阿魏酸的標準曲線溶液；
苯甲酸標準曲線溶液制備：取苯甲酸對照品約10mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含苯甲酸約0.1mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml苯甲酸的標準曲線溶液；
b、采用兩臺不同高效液相色譜儀，取步驟a中制得的7個不同濃度的標準曲線溶液按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。分別以各成分相對應的濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，繪制標準曲線；將羥基紅花黃色素A、阿魏酸、苯甲酸標準曲線的斜率分別除以芍藥苷標準曲線的斜率，即為各成分相對芍藥苷的校正因子，結果見表24。
表24各成分以芍藥苷為內參物的校正因子測定結果匯總
(3)按校正因子法(一測多評法)測定供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、對照品工作溶液制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，以50％甲醇水溶液為溶劑，制得含芍藥苷0.4mg/ml的對照品工作溶液。
b、供試品溶液制備：精密移取供試品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
c、測定方法：精密量取對照品混標工作溶液、供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。根據步驟(2)中確定的校正因子，按下述公式計算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供試品中各成分的含量，mg/ml
CR——對照品工作溶液中芍藥苷濃度，mg/ml
AR——對照品工作溶液中芍藥苷峰面積
AX——供試品溶液中各成分峰面積
F——各成分相對芍藥苷的校正因子
結論：
1、校正因子確定后，進行血必凈中間體羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸含量測定時，則無需采用三種不同的液相條件，分別配制對照品溶液，僅需配制一份供試品溶液，一份單一成分的對照品溶液，即可完成中間體中四種成分的含量測定，簡化了試驗步驟，克服了原方法的弊端。檢測結果色譜圖見：附圖3
實施例3
本發明所述的血必凈中間體功效成分含量檢測方法，包括以下步驟：
(1)液相色譜條件：
照高效液液色譜法測定：
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠；
流動相：甲醇：醋酸水溶液(1000ml水中加入36％冰醋酸水溶液5ml)(30：70)；
流速：1.2ml/min；
柱溫：30℃；
檢測波長：230nm；
進樣量：20μl；
運行時間：60min，
(2)以芍藥苷為內參物的相對校正因子的測定：
a、標準曲線溶液的制備：
羥基紅花黃色素A標準曲線溶液制備：取羥基紅花黃色素A對照品約20mg、精密稱定，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含羥基紅花黃色素A約2.0mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羥基紅花黃色素A的標準曲線溶液；
芍藥苷標準曲線溶液制備：取芍藥苷對照品約200mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含芍藥苷約2.0mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml芍藥苷的標準曲線溶液；
阿魏酸標準曲線溶液制備：取阿魏酸對照品約10mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含阿魏酸約0.1mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml阿魏酸的標準曲線溶液；
苯甲酸標準曲線溶液制備：取苯甲酸對照品約10mg、精密稱定，置100ml量瓶中，加50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制得每毫升含苯甲酸約0.1mg的對照品貯備溶液；分別精密移取貯備溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，分置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，制得分別含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml、16μg/ml苯甲酸的標準曲線溶液；
b、采用兩臺不同高效液相色譜儀，取步驟a中制得的7個不同濃度的標準曲線溶液按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。分別以各成分相對應的濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，繪制標準曲線；將羥基紅花黃色素A、阿魏酸、苯甲酸標準曲線的斜率分別除以芍藥苷標準曲線的斜率，即為各成分相對芍藥苷的校正因子，結果見表25。
表25各成分以芍藥苷為內參物的校正因子測定結果匯總
(3)按校正因子法(一測多評法)測定供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量：
a、對照品工作溶液制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，以50％甲醇水溶液為溶劑，制得含芍藥苷0.4mg/ml的對照品工作溶液。
b、供試品溶液制備：精密移取供試品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，取此溶液5ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
c、測定方法：精密量取對照品混標工作溶液、供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，按步驟(1)給定色譜條件進樣，記錄色譜圖。根據步驟(2)中確定的校正因子，按下述公式計算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量。
式中：X——供試品中各成分的含量，mg/ml
CR——對照品工作溶液中芍藥苷濃度，mg/ml
AR——對照品工作溶液中芍藥苷峰面積
AX——供試品溶液中各成分峰面積
F——各成分相對芍藥苷的校正因子
結論：
1、校正因子確定后，進行血必凈中間體羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸含量測定時，則無需采用三種不同的液相條件，分別配制對照品溶液，僅需配制一份供試品溶液，一份單一成分的對照品溶液，即可完成中間體中四種成分的含量測定，簡化了試驗步驟，克服了原方法的弊端。檢測結果色譜圖見：附圖4
實施例4、實施例1-3校正因子法(一測多評法)與外標法、原標準方法結果比對：
選取10份不同批號的血必凈中間體，分別采用實施例1-3校正因子法(一測多評法)，外標法(各成分分別制備對照品溶液)、原標準方法測定其中的羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、苯甲酸含量，結果見表26-29。
表26羥基紅花黃色素A方法比對試驗結果
表27藥苷方法比對試驗結果
表28阿魏酸方法比對試驗結果
表29苯甲酸方法比對試驗結果
從上表可以看出，采用本發明所確定的校正因子法(一測多評法)與現有質量標準中方法對同一樣品中所含的羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸的測定結果的相對平均偏差均小于5.0％，即無明顯偏差，校正因子法(一測多評法)法這一替代方案能實現對樣品中多指標成分的準確定量。
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