本發明屬于生物實驗方法的設計技術領域，具體涉及一種可定量測定細菌分泌性溶血素活性的測定方法。
背景技術：
溶血素(hemolysin/haemolysin)，又稱細胞溶素，是細菌分泌的能夠使細胞溶解的毒素。溶血素屬于穿孔毒素(pore-formingtoxin)，又名攻膜毒素(membranedisruptingtype)。1981年，fussle等人首次提出穿孔毒素的定義即跨細胞膜形成孔道的細菌蛋白毒素。根據溶血素結構、與結合細胞的方式、孔道形成機制和引起靶細胞反應的不同，又將眾多溶血素分別歸為重復子毒素家族(repeatsintoxinfamily，rtx)、硫醇活性膽固醇結合細胞溶素家族(familyofthiol-activated,cholesterol-bindingcytolysin)。還有個別溶血素未能歸入家族當中，如葡萄球菌α-溶血素。雖然各種溶血素都存在一定的差異，但是它們之間還有很多共同特征：(1)分子結構都是單鏈多肽蛋白。(2)蛋白都由質粒編碼。(3)溶血素都有溶解細胞作用。(4)作用機制都是以低聚物形式結合在細胞膜上形成孔道，進入細胞。(5)序列有一定的相似性，尤其同一家族溶血素分子結構、氨基酸序列更加相似。
據資料顯示，現在大部分與獸醫(醫)學相關的病原體都可產生穿孔毒素蛋白，而這些蛋白很多已經被指定為溶血素，因為它們能溶解紅細胞。很多革蘭氏陽性菌和陰性菌都產生溶血素，溶血素不同于其他通過哺乳動物靶細胞內化的毒素，而是作用于細胞膜，造成其結構和功能的紊亂，使大量細胞內的成分泄漏，導致細胞死亡。溶血素不僅溶解紅細胞，還損害其它多種類型的真核細胞，包括血小板、成纖維細胞、心肌細胞、單核細胞、粒細胞、內皮細胞等。此外，一些溶血素是公認的毒力因子，可使細菌產生致病力。
研究顯示突變菌株分泌物失去了它們原有的孔道形成功能以后，在動物試驗中顯示了顯著的毒力下降，如α-溶血素、e.coli溶血素和ply。α-溶血素抗體可以明顯的保護動物抵御金黃色葡萄球菌的各種感染。一些細菌的主要毒力因子即為溶血素，如豬鏈球菌溶血素(suilysin，sly)和李斯特菌溶血素(1isteriolysin，llo)，腸溶血素(enterohaemolysin，ehx)也是大腸桿菌o157毒力增強的原因之一。因此，溶血素可以作為評價細菌毒力的重要指標。
同時，細胞溶素對某些微生物的致病性有決定意義。分泌溶血素的細菌在中國并不罕見。安徽、福建、貴州、江蘇、河南等地區都在采樣時分離到了大腸桿菌o157菌株。豬鏈球菌近年來也時有發生，特別是2005年中國四川爆發的ii型豬鏈球菌病，造成了感染人員的死亡，對畜牧業危害極大并引起群眾恐慌，豬溶血素(suilysin)為該菌主要致病因子之一。另外，國內有關動物單核細胞增生李斯特菌病例的報道近年來也逐漸增多，波及全國十多個省市。作為一種重要的食源性傳染病的致病菌，該菌能導致人和動物嚴重的致死性疾病，是通過其主要致病因子溶血素(1isteriolysin)作用于內皮細胞，導致細胞因子變化而產生致病作用。
目前對細菌溶血素的定性測定的方法很多，最簡單的如5％綿羊血培養皿，培養24-48h后觀察溶血情況，pcr方法檢測細菌攜帶的各溶血素基因等，尚無報道溶血素的定量檢測方法，尤其是對細菌外分泌性溶血素總量的檢測。
本研究利用細菌分泌的溶血素可以溶解(穿孔)綿羊血紅細胞的特點，將引起50％紅細胞溶血所需的最小溶血素量定義為一個vh50u，可計算出待測細菌液體培養時上清中分泌的溶血素的量，以vh50u/ml表示，該方法可以用于反映細菌液體培養時外分泌性溶血素的總量，培養條件對細菌分泌性溶血素產量的影響和通過比較同一種不同菌株分泌的溶血素產量初步比較其毒力差異。
技術實現要素：
本發明的目的在于：設計一種測定方法，能很好的定量測定細菌溶血素。
本發明的技術方案：一種可定量測定細菌分泌性溶血素活性的測定方法，該測定方法包括下述步驟：
一、試劑及配制
(一)血細胞保存液的制備：葡萄糖2.05g；檸橡酸鈉0.8g；氯化鈉0.42g；蒸餾100ml，以上成分混勻溶解后，用檸檬酸調節ph為6.1，115℃濕熱滅菌15min，4℃保存備用；
(二)緩沖生理鹽水：貯存液制備：十二水磷酸氫二鈉2.85g；磷酸二氫鉀0.27g；氯化鈉17.00g；加蒸餾水至100毫升，4℃保存備用；緩沖液制備：5毫升貯存液加95毫升蒸餾水，再加10％硫酸鎂0.1毫升，當日配制12小時內使用；
(三)1％綿羊紅細胞制備及保存：
無菌采取綿羊血液于在等量的血細胞保存液中，4±2℃保存備用；使用前以3-10倍體積的緩沖液洗3次，1500轉/分鐘，前兩次離心5min，最后一次10min，吸棄上清液，并使用緩沖液配成1％紅細胞液，4±2℃可儲存24小時備用；
(四)待測溶血素制備與保存
細菌液體培養物1-5ml，4℃，5000-8000×g離心5-10分鐘，取上清，-20℃保存；
二、采用試管法進行測定操作
(一)稀釋溶血素：待測溶血素50μl，加緩沖液5ml，稀釋度為1:100；
(二)配制溶血標準管：1％綿羊紅細胞1.6ml加2.4ml蒸餾水，混勻，即為全溶血管；取全溶血管液2ml加緩沖液2ml，即為50％溶血管；
(三)按下表所示，稀釋的待測溶血素、緩沖液和紅細胞依次加入試管中，混勻，置37℃水浴30分鐘；第0管為非溶血對照；
細菌溶血素vh50測定試管法
(四)結果測定：取出試管，1500rpm/min離心2-5分鐘，對照管應不溶血；肉眼比色，選與50％溶血標準管相近二管，再用分光光度計測，波長542nm、0.5cm比色杯od值，確定與標準管最接近者為終點管，然后按下公式計算：細菌溶血素量(vh50u/ml)＝(1,000/vh50溶血素用量)×稀釋度即可完成測定；
或者二、采用微孔法進行測定操作
(一)稀釋溶血素：待測溶血素50μl，加緩沖液5ml，稀釋度為1:100；
(二)配制溶血標準孔：1％綿羊紅細胞800μl加1200μl蒸餾水，混勻，即為全溶血孔，取250μl加入全溶血孔；取全溶血孔液600μl加緩沖液600μl，即為50％溶血孔，取250μl加入50％溶血孔；
(三)按下表所示，稀釋的待測溶血素、緩沖液和紅細胞依次加入“v”型底微孔板的反應孔中，混勻，置37℃水浴30分鐘；第0管為非溶血對孔；每個孔做三個以上復孔；
微孔法測定細菌溶血素vh50
(四)結果測定：取出微孔板，1500rpm/min離心5分鐘，另取“u”型底微孔板，每孔吸取100μl到對應的“u”型底微孔板中，對照孔應不溶血；用分光光度計測，波長542nmod值，計算復孔平均值，確定與標準50％溶血孔第一接近孔為終點孔，與終點孔緊鄰且與標準50％溶血管的od542值第二接近孔為次終點孔，根據終點孔和次終點孔建立y＝ax+b線性方程，其中x為待測溶血素添加量，根據標準50％溶血管的od542值計算待測溶血素用量；然后按下公式計算：細菌溶血素量(vh50u/ml)＝(1,000/vh50溶血素用量)×稀釋度即可完成測定。
有益效果：利用細菌分泌的溶血素可以溶解(穿孔)綿羊血紅細胞的特點，當紅細胞和細菌產生的溶血素量一定時，在規定反應的時間內，紅細胞溶解數量與溶血素蛋白分泌量量呈正相關。在接近50％溶血(vh50)時，二者之間近似直線關系，將50％紅細胞溶血作為敏感的判斷終點。定義引起50％紅細胞溶血所需的最小溶血素量為一個vh50u，可計算出待測細菌液體培養時上清中分泌的溶血素的量，以vh50u/ml表示。
本方法中列舉的用于定量測定細菌分泌性溶血素活性的試管法可以用于少量樣本測試；列舉的用于定量測定細菌分泌性溶血素活性的微孔法可用于大量樣本的快速測定。用該方法可以定量測定細菌液體培養時外分泌性溶血素的產量，培養條件對細菌分泌性溶血素產量的影響和通過比較同一種不同菌株分泌的溶血素產量初步比較其毒力差異。
具體實施方式
實施例1、一種可定量測定細菌分泌性溶血素活性的測定方法，該測定方法包括下述步驟：
一、試劑及配制
(一)血細胞保存液的制備：葡萄糖2.05g；檸橡酸鈉0.8g；氯化鈉0.42g；蒸餾100ml，以上成分混勻溶解后，用檸檬酸調節ph為6.1，115℃濕熱滅菌15min，4℃保存備用；
(二)緩沖生理鹽水：貯存液制備：十二水磷酸氫二鈉2.85g；磷酸二氫鉀0.27g；氯化鈉17.00g；加蒸餾水至100毫升，4℃保存備用；緩沖液制備：5毫升貯存液加95毫升蒸餾水，再加10％硫酸鎂0.1毫升，當日配制12小時內使用；
(三)1％綿羊紅細胞制備及保存：
無菌采取綿羊血液于在等量的血細胞保存液中，4±2℃可保存3周；使用前以3-10倍體積的緩沖液洗3次，1500轉/分鐘，前兩次離心5min，最后一次10min，吸棄上清液，并使用緩沖液配成1％細胞懸液，制備好的紅細胞液4±2℃可儲存24小時備用；
(四)待測溶血素制備與保存
細菌液體培養物1-5ml，4℃，5000-8000×g離心5-10分鐘，取上清，-20℃保存；
二、采用試管法進行測定操作
(一)稀釋溶血素：待測溶血素50μl，加緩沖液5ml，稀釋度為1:100；
(二)配制溶血標準管：1％綿羊紅細胞1.6ml加2.4ml蒸餾水，混勻，即為全溶血管；取全溶血管液2ml加緩沖液2ml，即為50％溶血管；
(三)按下表所示，稀釋的待測溶血素、緩沖液和紅細胞依次加入試管中，混勻，置37℃水浴30分鐘；第0管為非溶血對照；
細菌溶血素vh50測定試管法
(四)結果測定：取出試管，1500rpm/min離心2-5分鐘，對照管應不溶血；肉眼比色，選與50％溶血標準管相近二管，再用分光光度計測，波長542nm、0.5cm比色杯od值，確定與標準管最接近者為終點管，然后按下公式計算：細菌溶血素量(vh50u/ml)＝(1,000/vh50溶血素用量)×稀釋度即可完成測定；
例如第3管為終點管：細菌溶血素量(vh50u/ml)＝(1,000/100)×100，待測溶血素的量為1,000vh50u/ml。
為使結果更為精確，可根據標準50％溶血管的od542值，選擇終點管(第3管)，在第2、4號管中選取最接近標準50％溶血管od542值，建立y(od542值)＝ax(待測溶血素添加量)+b線性方程，根據標準50％溶血管的od542值計算待測溶血素添加量。
或者
縮小待測溶血素量梯度，即第3管(100μl)為終點管或結果介于第3管與第4管之間，設置60、80、100、120、140、160μl，見下表，按照上述方法再次測定。
細菌溶血素vh50測定試管法(精細)
實施例2、與實施例1具有相同的步驟一，步驟二采用微孔法進行測定操作
(一)稀釋溶血素：待測溶血素50μl，加緩沖液5ml，稀釋度為1:100；
(二)配制溶血標準孔：1％綿羊紅細胞800μl加1200μl蒸餾水，混勻，即為全溶血孔，取250μl加入全溶血孔；取全溶血孔液600μl加緩沖液600μl，即為50％溶血孔，取250μl加入50％溶血孔；
(三)按下表所示，稀釋的待測溶血素、緩沖液和紅細胞依次加入“v”型底微孔板的反應孔中，混勻，置37℃水浴30分鐘；第0管為非溶血對孔；每個孔做三個以上復孔；
微孔法測定細菌溶血素vh50
(四)結果測定：取出微孔板，1500rpm/min離心5分鐘，另取“u”型底微孔板，每孔吸取100μl到對應的“u”型底微孔板中，對照孔應不溶血；用分光光度計測，波長542nmod值，計算復孔平均值，確定與標準50％溶血孔第一接近孔為終點孔，與終點孔緊鄰且與標準50％溶血管的od542值第二接近孔為次終點孔，根據終點孔和次終點孔建立y＝ax+b線性方程，其中x為待測溶血素添加量，根據標準50％溶血管的od542值計算待測溶血素用量；然后按下公式計算：細菌溶血素量(vh50u/ml)＝(1,000/vh50溶血素用量)×稀釋度即可完成測定。
實施例3、金黃色葡萄球菌分泌性溶血素活性的定量測定
金黃色葡萄球菌可分泌α、β、γ、δ、ε等溶血素，不同菌株分泌溶血素的量和溶血素蛋白的活性存在差異。
1.材料方法
1.1菌株：新疆野外分離株xj69、xjna10、xj92、xj50和xjcp-1
1.2培養：50％甘油保存菌種，取50μl直接加入4ml哥倫比亞液體培養基中，37℃，170rpm振搖培養20h。
2.溶血素定量測定
按照實施例1的試管法操作步驟進行。
3.結果
金黃色葡萄球菌分泌性溶血素活性的測定
實施例4、培養條件對金黃色葡萄球菌分泌性溶血素產量的影響
金黃色葡萄球菌可分泌α、β、γ、δ、ε等溶血素，同一菌株在不同培養條件(培養基、培養時間、氣體環境等)下分泌溶血素的量和活性存在差異，通過測定細菌分泌的溶血素的vh50u/ml可以比較不同培養條件對細菌分泌溶血素的影響。
1.材料方法
1.1菌株：新疆野外分離株xj69、xj92和xj50
1.2培養：選擇哥倫比亞液體培養基、馬丁肉湯、腦心浸湯、lb液體四種培養基，其它培養條件相同，37℃，170rpm振搖培養20h。將各菌種均接種(50μl)到以上5種培養基(4ml)中，如下表：
2.前處理
按照以下流程進行準備：
(1)分別取各菌株不同培養基均勻培養物1ml，4℃，5,000-8,000×g離心1-2分鐘，去上清；
(2)清洗，使用等體積應用液重懸，按照上述條件離心，棄去上清；
(3)重復步驟(2)2-3次；
(4)使用等體積應用液重懸，并稀釋5～20倍，測定od值(波長600nm)，使稀釋后od600值介于0.2～0.8，否則繼續稀釋；
(5)計算同一菌株在不同培養基中的od600，od600＝od600(測定值)×稀釋倍數；并確定同一菌株在不同培養基中培養后最大和最小od600；
(6)以1ml最小od600培養基的培養物為參考，取其它培養基培養物(xml)并使用緩沖液補足到1ml，此時od600值與參考一致。
x(取樣量(ml))＝最小od600培養物/取樣培養物od600
(7)將上述1ml調整后的培養物，5,000-8,000×g離心5-10分鐘，取上清，-20℃保存。
2.溶血素測定
按照實施例2的微孔法操作步驟進行。
3.結果
相同培養條件下，不同金黃色葡萄球菌菌株在各培養基中分泌溶血素活性的測定
實施例5、通過不同金黃色葡萄球菌菌株分泌的溶血素活性的差異評價其毒力
大多數細菌(人和動物致病菌)可以分泌多種致病因子(毒素)，其中溶血素是其主要的致病因子，通過測定其分泌的溶血素的vh50u/ml可以初步比較不同菌株的毒力差異。
金黃色葡萄球菌可分泌多種致病因子，其中α、β、γ、δ、ε等溶血素是其主要的致病因子，不同菌株在相同培養條件下(培養基、培養時間、氣體環境等一致)下分泌溶血素的量和活性存在差異，通過測定不同菌株分泌的溶血素的vh50u/ml可以初步比較不同菌株的毒力差異。
1.材料方法
1.1菌株：新疆野外分離株xj69、xjna10、xj92和xj50，通過小鼠的人工感染試驗已確定其毒力為xj69、xjna10>xj92>xj50。
1.2培養
50％甘油保存菌種，取50μl直接加入4ml哥倫比亞液體培養基中，37℃，170rpm振搖培養20h。
2.測定前處理
按照以下流程進行準備：
(1)分別取各菌株均勻培養物1ml，4℃，5,000-8,000×g離心1-2分鐘，去上清；
(2)清洗，使用等體積pbs(ph7.2±0.2)重懸，按照上述條件離心，棄去上清；
(3)重復步驟(2)2-3次；
(4)使用等體積pbs(ph7.2±0.2)重懸，并稀釋5～20倍，測定od值(波長600nm)，使稀釋后od600值介于0.2～0.8，否則繼續稀釋；
(5)計算不同菌株的od600，od600＝od600(測定值)×稀釋倍數；并確定最大和最小od600；
(6)重新取1ml最小od600的均勻培養物并作為參考，重新取其它菌株的均勻培養物(xml)并使用緩沖液補足到1ml，此時od600值與參考一致。
x取樣量(ml)＝最小od600培養物/取樣培養物od600
(7)將上述1ml調整后的培養物，5,000-8,000×g離心5-10分鐘，取上清，-20℃保存。
2.溶血素測定
按照實施例1的試管法操作步驟進行。
3.結果
金黃色葡萄球菌分泌溶血素活性的測定
與通過小鼠的人工感染試驗已確定的毒力比較結果xj69、xjna10>xj92>xj50基本一致。