本發明涉及蛋白生物，尤其涉及一種天然寬范圍蛋白質分子量標準品及其制備方法。

背景技術：

1、藍色非變性膠凝膠電泳(blue?nativepage，bn-page)可用于從生物膜和總細胞中一步分離蛋白質復合物組織勻漿。它還可用于確定天然蛋白質質量和寡聚狀態并鑒定生理學蛋白質-蛋白質相互作用。在非變性凝膠電泳中需要用到蛋白質分子量標準試劑盒。它包含一系列已知分子量的蛋白質分子量標準品，用于幫助研究人員在非變性電泳條件下估算樣品蛋白質的相對分子量，并監測蛋白質免疫印跡法中電泳分離或轉移的過程。與十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(一種變性膠sds-page)不同，非變性電泳不使用還原劑和去污劑，因此蛋白質保持其天然構象，包括多亞基復合物和二聚體等，可以更清楚地了解蛋白質之間的相互作用方式和機制。

2、目前市面上多種商業化sds-page蛋白分子量標準已被開發，而非變性蛋白分子量標準試劑盒廠家卻寥寥無幾，且目前常用的非變性膠電泳蛋白質標準物的分子量范圍大多在12.4-450kda、45-669kda、66-669kda及45～880kda，這些試劑盒的蛋白分子量范圍較小且產品價格昂貴。目前尚未有寬范圍超高分子量的蛋白標準物。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題是提供一種寬范圍超高分子量的蛋白標準物，填補市面上只有小分子量到較高分子量范圍(12.4-880kda)蛋白標準物的空白。

2、為了解決上述問題，本發明提出以下技術方案：

3、一方面，本發明提供一種天然寬范圍蛋白質分子量標準品，所述天然寬范圍蛋白質分子量標準品的分子量范圍至少包括200kda至1.7mda。

4、其進一步的技術方案為，所述天然寬范圍蛋白質分子量標準品至少包含6種不同的純化的蛋白。

5、其進一步的技術方案為，所述6種不同的蛋白，分子量依次為1.7mda、1.5mda、1.0mda、700kda、500kda、200kda。

6、其進一步的技術方案為，所述6種不同的蛋白為未染色的蛋白且具有不同的電泳遷移率。

7、其進一步的技術方案為，所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品來源于動物體組織。

8、其進一步的技術方案為，所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品適用于非變性凝膠電泳。

9、另一方面，本發明還提供以上所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品的制備方法，包括以下步驟：

10、s1、取新鮮豬心，去除表面脂肪，剪成不大于1.0厘米×1.0厘米×1.0厘米的小塊，冰上放置，用提前預冷的超純水清洗兩到三次；

11、s2、在研磨器中加入10-40毫升裂解緩沖液，將剪碎的組織放入其中，勻漿20-60s，暫停20-40s，重復3-5次；

12、s3、將勻漿液加入50ml離心管中，2～8℃下1,000～5,000g離心5-20分鐘，將細胞核以及大的細胞碎片沉降下來，留取上清液；

13、s4、將上清液用紗布過濾，將濾液在2～8℃下15,000～30,000g離心10-30分鐘，得到沉淀；

14、s5、用裂解緩沖液將沉淀重懸，在2～8℃下15,000～30,000g離心10-30分鐘，得到的沉淀用電泳緩沖液重懸，向其中加入終濃度為0.5-3％洋地黃皂苷，2～8℃，抽提30分鐘，10,000～20,000g離心30分鐘，得到的上清液即為高純度天然寬范圍蛋白質分子量標準品。

15、其進一步的技術方案為，所述裂解緩沖液含有5-15mm三羥甲基氨基甲烷，ph?7.0-7.8，0.2-0.3m蔗糖，0.1-0.3mm乙二胺四乙酸。

16、其進一步的技術方案為，所述裂解緩沖液含有5-15mm三羥甲基氨基甲烷，ph?7.0-7.8、0.1-0.3mm乙二胺四乙酸溶液。

17、本發明還提供一種試劑盒，所述試劑盒包含第一方面所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品。

18、與現有技術相比，本發明所能達到的技術效果包括：

19、本發明提供的天然寬范圍蛋白質分子量標準品，分子量范圍至少包括200kda至1.7mda，具有寬范圍、高克重、超高分子量的特點，填補了目前市面上只有小分子量到較高分子量范圍(12.4-880kda)蛋白標準物的空白。

20、本發明提供的天然寬范圍蛋白質分子量標準品的制備方法，原料來源天然，制備方法簡單，產物性質穩定，可以在-20℃和-80℃長期保存的情況下，分子量分布均沒有變化，尤其適合用做標準品。

技術特征：

1.一種天然寬范圍蛋白質分子量標準品，其特征在于，所述天然寬范圍蛋白質分子量標準品的分子量范圍至少包括200kda至1.7mda。

2.如權利要求1所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品，其特征在于，至少包含6種不同的純化的蛋白。

3.如權利要求2所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品，其特征在于，所述6種不同的蛋白為未染色的蛋白且具有不同的電泳遷移率。

4.如權利要求2所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品，其特征在于，所述6種不同的蛋白，分子量依次為1.7mda、1.5mda、1.0mda、700kda、500kda、200kda。

5.如權利要求1所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品，其特征在于，所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品來源于動物體組織。

6.如權利要求1所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品，其特征在于，所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品適用于非變性凝膠電泳。

7.一種如權利要求1-6任一項所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述裂解緩沖液含有5-15mm三羥甲基氨基甲烷，ph?7.0-7.8，0.2-0.3m蔗糖，0.1-0.3mm乙二胺四乙酸。

9.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述裂解緩沖液含有5-15mm三羥甲基氨基甲烷，ph?7.0-7.8、0.1-0.3mm乙二胺四乙酸溶液。

10.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權利要求1-6任一項所述的天然寬范圍蛋白質分子量標準品。

技術總結
本發明公開了一種天然寬范圍蛋白質分子量標準品及其制備方法，涉及蛋白生物技術領域。本發明提供的天然寬范圍蛋白質分子量標準品，分子量范圍至少包括200kDa至1.7MDa，具有寬范圍、高克重、超高分子量的特點，填補了目前市面上只有小分子量到較高分子量范圍(12.4?880kDa)蛋白標準物的空白。本發明提供的天然寬范圍蛋白質分子量標準品的制備方法，原料來源天然，成本低，制備方法簡單，產物性質穩定，可以在?20℃和?80℃長期保存的情況下，分子量分布均沒有變化，尤其適合用做標準品。

技術研發人員：谷金科,吳博雯,周宇喬,黃廣發,劉夢玲
受保護的技術使用者：深圳大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24