本發(fā)明屬于藥物原料檢測(cè)，涉及初始原料蘋果酸的檢測(cè)，特別設(shè)計(jì)一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法。

背景技術(shù)：

1、d(+)-蘋果酸是一種是重要的手性化合物，廣泛應(yīng)用于手性藥物合成、手性拆分試劑和手性助劑等領(lǐng)域，具有重要的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

2、d(+)-蘋果酸工業(yè)化生產(chǎn)主要是由酶工程法制得，由于工藝控制的局限性，d(+)-蘋果酸制備過(guò)程中中會(huì)產(chǎn)生富馬酸、馬來(lái)酸及l(fā)(-)-蘋果酸等工藝雜質(zhì)，其中l(wèi)(-)-蘋果酸為d(+)-蘋果酸的光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)，d(+)-蘋果酸及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)如下：

3、

4、d(+)-蘋果酸中含有的l(-)-蘋果酸會(huì)導(dǎo)致合成最終產(chǎn)品的光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)偏高，即必須嚴(yán)格控制l(-)-蘋果酸的含量，所以對(duì)d(+)-蘋果酸中的l(-)-蘋果酸測(cè)定方法的研究具有重要意義。

5、段先哲等、正相高效液相色譜法測(cè)定l-蘋果酸中的對(duì)映異構(gòu)體d-蘋果酸，分析儀器，2016年第2期，25-29頁(yè)：采用正相液相色譜系統(tǒng)測(cè)定l-蘋果酸中的對(duì)映異構(gòu)體d-蘋果酸，其系統(tǒng)適用性溶液中未加入富馬酸和馬來(lái)酸，按照該方法嘗試檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸,馬來(lái)酸與l(-)-蘋果酸無(wú)法有效分離，樣品中馬來(lái)酸干擾l(-)-蘋果酸的測(cè)定，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相比例等色譜條件，仍然無(wú)法有效分離。

6、中國(guó)申請(qǐng)專利cn?112881579?a公開(kāi)了一種正相液相色譜法檢測(cè)l-蘋果酸中的d-蘋果酸，按照該方法嘗試檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸,富馬酸、馬來(lái)酸、l(-)-蘋果酸及d(+)-蘋果酸峰之間均可有效分離，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該方法下l(-)-蘋果酸的濃度與峰面積線性關(guān)系較差，且l(-)-蘋果酸檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)l(-)-蘋果酸的含量。

7、以上兩種方法均采用正相液相色譜法：方法使用正己烷和異丙醇作為流動(dòng)相，由于正己烷極易揮發(fā)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室彌漫著正己烷的氣味，非常難聞；正相色譜的色譜峰保留時(shí)間受溫度影響較大，特別是在夏天時(shí)，常會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間明顯漂移。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法，通過(guò)本發(fā)明方法控制d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸含量，從而保證d(+)-蘋果酸作為手性化合物應(yīng)用于合成中確保最終產(chǎn)品的光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的可控性。

2、本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法，包括以下步驟：

4、(1)配制供試品溶液：精密稱取d(+)-蘋果酸待測(cè)樣品，置于量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻得供試品溶液；

5、(2)配制對(duì)照品貯備液：精密稱取l(-)-蘋果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成對(duì)照品貯備液；

6、(3)配制對(duì)照品溶液：精密稱取d(+)-蘋果酸待測(cè)樣品，置于量瓶中，精密加入對(duì)照品貯備液1ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

7、(4)測(cè)定：精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3倍；

8、色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250mm×4.6mm，5μm)；

9、以無(wú)水醋酸銅、l-亮氨酸的混合溶液為流動(dòng)相；

10、流速為每分鐘1.0ml；

11、檢測(cè)波長(zhǎng)為302nm；

12、柱溫為30℃；

13、進(jìn)樣體積50μl。

14、本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)方案為：

15、所述供試品溶液的濃度為2mg/ml。

16、進(jìn)一步的，所述對(duì)照品貯備液的濃度為100μg/ml。

17、進(jìn)一步的，所述對(duì)照品溶液中待測(cè)樣品的濃度為2mg/ml。

18、進(jìn)一步的，所述流動(dòng)相中無(wú)水醋酸銅的濃度為1.5mg/ml，l-亮氨酸的濃度為2mg/ml。

19、本發(fā)明的有益效果為：

20、本發(fā)明提供的方法可以有效將馬來(lái)酸、富馬酸、l(-)-蘋果酸及d(+)-蘋果酸分離，可簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的含量。本發(fā)明方法基于反相液相色譜，成熟通用，使用水系流動(dòng)相，避免使用任何有機(jī)溶劑，不存在現(xiàn)有技術(shù)中正相液相色譜的缺陷。

技術(shù)特征：

1.一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法，其特征在于：所述供試品溶液的濃度為2mg/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法，其特征在于：所述對(duì)照品貯備液的濃度為100μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法，其特征在于：所述對(duì)照品溶液中待測(cè)樣品的濃度為2mg/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相液相色譜法檢測(cè)d(+)-蘋果酸中l(wèi)(-)-蘋果酸的方法，其特征在于：所述流動(dòng)相中無(wú)水醋酸銅的濃度為1.5mg/ml，l-亮氨酸的濃度為2mg/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于藥物原料檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種反相液相色譜法檢測(cè)D(+)?蘋果酸中L(?)?蘋果酸的方法，所述方法包括以下步驟：精密稱取D(+)?蘋果酸待測(cè)樣品，置于量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻得供試品溶液；精密稱取L(?)?蘋果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成對(duì)照品貯備液；精密稱取D(+)?蘋果酸待測(cè)樣品，置于量瓶中，精密加入對(duì)照品貯備液1ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3倍。本發(fā)明提供的方法可以有效將馬來(lái)酸、富馬酸、L(?)?蘋果酸及D(+)?蘋果酸分離，可簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)D(+)?蘋果酸中L(?)?蘋果酸的含量。

技術(shù)研發(fā)人員：梁中衛(wèi),蔡金勇,王春建,成芳,丁愛(ài)忠,倪佳,洪林云,林玲,劉文麗
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28