本發明提供了一種檢測口蹄疫病毒a型中和抗體的管式磁微粒化學發光檢測試劑盒和應用，屬于體外檢測。

背景技術：

1、口蹄疫（foot?and?mouth?disease,?fmd）是由口蹄疫病毒（foot?and?mouthdisease?virus,?fmdv）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要感染豬、牛、羊等偶蹄動物，給畜牧業造成巨大的經濟損失，嚴重影響國際貿易。世界動物衛生組織（woah）將其列為必報動物傳染病，我國將其列為一類動物傳染病之首。fmdv是一種小rna病毒，高度變異，有o、a、c、asia?1、sat1、sat2、sat3七個血清型，各血清型間無交叉免疫保護，同一血清型不同譜系病毒之間也存在抗原結構的差異，不能對異源毒株提供很好的交叉免疫保護。我國流行的fmdv血清型主要有o型和a型。fmdv?a型是抗原性變異最大的一個血清型，不同譜系病毒的抗原性變異較大，交叉免疫保護作用較差，給疫苗和診斷試劑研發帶來了很大困擾。在口蹄疫流行國家，主要使用滅活疫苗對fmd進行免疫預防。疫苗免疫后抗體水平的檢測是評估免疫效果、制定免疫程序的重要依據。中和抗體是宿主抵抗fmdv感染的主要保護性免疫成分。病毒中和試驗（vnt）是檢測中和抗體的“金標準”，但該方法要動用活病毒，存在散毒風險，需要在高級別生物安全實驗室操作，實驗周期長，細胞狀態對實驗結果影響大，結果重復性差，且不適于大規模血清樣本的檢測。檢測fmdv結構蛋白抗體的液湘阻斷elisa和固湘競爭elisa因其操作安全、重復性好而得到廣泛應用。但是傳統的基于兔子和豚鼠多克隆抗血清的elisa方法，檢測的即有中和抗體，也有非中和抗體，與攻毒保護的相關性不高。因而建立一種安全、高效、快速、全自動的中和抗體檢測方法可以為口蹄疫防控提供強有力技術支撐。

2、診斷檢測試劑盒的敏感性和特異性等性能很大程度上取決于單抗的選擇。識別單個表位的抗體能否代表fmdv衣殼上不同表位的整體抗體反應。因此，單抗所識別的表位應該是具有免疫優勢的，并且與宿主動物產生的大多數fmdv抗體所識別表位重疊。本研究前期通過單個b細胞抗體技術研制成功牛源單抗w125和w145，二者均為fmdv?a型型內廣譜中和抗體，能夠中和國內流行的所有代表毒株，包括sea97譜系中g1（代表毒株a/wh/cha/09fmdv）和g2（代表毒株a/gdmm/cha/2013?fmdv）兩個分支的病毒，也能中和af72疫苗毒株（a22亞型毒株）。抗體w145識別a型病毒vp1?rgd+2位關鍵氨基酸，結合病毒的受體結合位點，發揮阻斷病毒入侵細胞的中和作用（li?et?al,?2023,?plos?pathogens,?2023,19(11):e1011811）。同時，與該位點相鄰的vp3、vp2部分中和位點抗體的結合，也會對w145抗體的結合產生位阻效應，從而可以準確的反映中和抗體的應答水平。受體結合位點是最重要的中和位點，也是免疫優勢性最強的中和位點。通過精確檢測該位點抗體應答就可以真實反映中和抗體的應答水平。w125識別抗原位點覆蓋vp2上的b-c、e-f和h-i環以及vp3上的b-b結節和h-i環。w145結合w125抗體其識別位點幾乎覆蓋了fmdv結構蛋白上所有優勢中和抗原表位（li?et?al,?2023,?plos?pathogens）。

3、化學發光免疫分析（chemiluminescence?immunoassay，clia）技術結合了酶聯免疫分析以及化學發光技術，具有敏感性高、操作簡便、易于自動化等優點，在臨床診斷、藥物分析、動物疫病檢測等方面得到廣泛應用。磁性微粒（magnetic?particle,?mp）作為clia的新型固相載體材料，與傳統的聚苯乙烯微孔板相比，表面積大，通過共價鍵連接抗原/抗體更加牢固，免疫反應在幾乎全液相的狀態下進行，具有快速、高通量、全自動化、操作便捷等特點。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發明針對現有vnt、elisa檢測技術的不足，提供一種安全、快速、自動化檢測fmdva型中和抗體的磁微粒clia試劑盒及其應用，能夠定量檢測動物血清中fmdva型中和抗體，用于疫苗免疫效力的評估。

2、本發明檢測口蹄疫病毒a型中和抗體的管式磁微粒化學發光檢測試劑盒，包括磁微粒偶聯單抗w125工作液和酶標抗體工作液。所述單抗w125的重鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。所述酶標抗體工作液中酶為堿性磷酸酶；所述酶標抗體工作液中抗體為單抗w145，所述單抗w145的重鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

3、單抗w125的重鏈可變區的氨基酸序列：

4、qvqlresgpslvkpsqtlsltctvsgfslstyavywvrqapgkaleclgsvssgdyltynpalksrltitkdnsksevslsvstvtpedtatyycakshssgyngwidfgcyeftgygpryvdawgqgvqvtvss；

5、單抗w125的輕鏈可變區的氨基酸序列：

6、waqavltqpssvsgslgqrvsitcsgsssnvglgnyvswfqqipgsaprtliygatnqasgvpdrfsgsrsgntatltisslqaedeanyfcaspdssqtifgsgttltvlg；

7、單抗w145的重鏈可變區的氨基酸序列：

8、qaqlresgpslvkpsqtlsltctvsgfslstcavvwvrqtpgkalewigrlardgttyynpalksrlsitkdnsktrvslslssvtpedtatyycgkdvpdyigyaeeidvdvwgqgllvtvss；

9、單抗w145的輕鏈可變區的氨基酸序列：

10、waqavltqpssvsgslgqrvsitcsgsssnvgqgdyvswfqqipgsaprtliyaatsrasgvpdrfsgsrsgntatltirsfqaedeadyfcsspdnsgnayfgsgttltvlg；

11、所述磁微粒偶聯單抗w125工作液中，磁微粒與單抗w125的質量比為100:（1~10）。

12、所述磁微粒偶聯單抗w125工作液中磁微粒濃度0.5mg/ml；酶標抗體工作液，濃度1:1000。

13、所述試劑盒還包括檢測抗原、濃縮洗滌液、發光底物、質控品、稀釋液、標準品。

14、所述檢測抗原為146s抗原，檢測抗原濃度0.25μg/ml。所述濃縮洗滌液為含有體積濃度0?.1％～0?.5％的tween-20的ph值7.4的pbs緩沖液。所述濃縮洗滌液為每10000ml水中含氯化鈉2000.0g、氯化鉀50.0g、十二水合磷酸氫二鈉725.0g、磷酸二氫鉀?50.0g、吐溫20?125ml，ph值為7.4。所述發光底物為3-（2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1,2-二氧環乙烷。所述質控品包括質控品1和質控品2，質控品1為0~10u陰性血清，質控品2為fmdv?a型抗體含量為100u的標準品。

15、所述稀釋液為磁微粒偶聯單抗w125工作液和酶標抗體工作液所用稀釋液，所述稀釋液為0.1m?ph=7的mops緩沖液；所述mops緩沖液含有質量百分含量為0.1~2%的bsa、0.01~0.5%的tween-20、0.01~0.5%的proclin300、0.01~0.5m的mgcl2、0.01~0.5m的nacl、0.05~3%的水解乳蛋白和0.1~1%的peg?6000。

16、所述標準品為fmdva型中和抗體含量為3200u、1600u、800u、400u、200u、100u、50u、25u、12.5u、6.25u、3.125u（1﹕4）、1.56u（1﹕2）、0u的抗血清。

17、本發明中所用單克隆抗體w125和w145均為利用單個b細胞抗體技術研制而成的fmdv宿主源抗體，擁有唯一的抗體基因序列信息，實現了抗體信息的數字化永久保存，不會丟失；可以根據序列信息合成抗體的表達質粒，轉染cho細胞表達獲得中和抗體。該試劑盒檢測靶標為病毒感染或疫苗免疫后產生的中和抗體，抗體w145識別a型病毒vp1?rgd+2位關鍵氨基酸，結合病毒的受體結合位點，發揮阻斷病毒入侵細胞的中和作用。受體結合位點是最重要的中和位點，也是免疫優勢性最強的中和位點。通過精確檢測該位點抗體應答就可以真實反映中和抗體的應答水平。w125識別抗原位點覆蓋vp2上的b-c、e-f和h-i環以及vp3上的b-b結節和h-i環。w145結合w125抗體其識別位點幾乎覆蓋了fmdv結構蛋白上所有優勢中和抗原表位。w145與w125均為fmdva型型內廣譜中和抗體，能夠中和我國流行的所有代表毒株，如fmdva/wh/cha/09（sea97譜系g1分支）、fmdv?a/gdmm/cha/2013（sea97譜系g2分支）和af72疫苗毒株（a22亞型毒株），形成了檢測不同a型口蹄疫疫苗免疫后中和抗體的通用檢測模式。

18、檢測時，首先將待測樣本、fmdva型抗原、ap-w145和適量mps-w125混合，37?℃孵育15min；用磁力板吸附磁珠1?min，棄去反應液，加清洗液重懸磁珠后再進行吸附清洗，如此重復4?次后棄去清洗液，加入100μl化學發光底物amppd，混勻磁珠，37?℃孵育3min，檢測相對發光強度（relative?light?unit，rlu），計算抗體含量。使用該方法檢測標準品，擬合標準曲線，并檢測343份背景清楚的血清樣本，通過roc曲線分析，確定clia方法的最佳cut-off值為41.395u，此時，該方法的敏感性為95.93%，特異性為100%。

19、綜合上所述，本發明使用磁微粒作為固相載體偶聯fmdv?a型牛源單抗w125（mps-w125），以堿性磷酸酶（alkaline?phosphatase，ap）標記fmdv?a型牛源單抗w145（ap-w145），fmdva/wh/cha/09146s為檢測抗原，3-（2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1,2-二氧環乙烷（amppd）為發光底物，建立了一種檢測fmdv?a?型中和抗體的磁微粒clia方法，并組裝成快速檢測試劑盒。同時配套全自動化學發光免疫分析儀，實現了對fmdv?a型中和抗體的定量、快速、自動化檢測。