專利名稱：一種靈芝雜交育種方法
技術領域：
本發明涉及一種食用菌育種方法，特別是一種靈芝雜交 育種方法。
背景技術：
食用菌的育種方法一般包括野生種馴化、誘變育種、原 生質體融合育種、基因工程育種和雜交育種等。
野生種馴化是從野生靈芝子實體中分離獲得菌絲體，經過栽培試驗， 篩選獲得優良菌種，這種育種方法需要分離獲得大量的菌株，從中選出高 產優質的品種，只能從現有的菌株中篩選，不能創造出新的種性。
誘變育種是通過物理或化學的手段，促進變異，再從眾多的變異體 中篩選出好的品種，這是一種隨機性很強育種方法，需要大量的篩選才有 可能獲得好品種。
原生質體融合育種是一種用于遠緣雜交克服"種間性隔離"的技術， 上世紀八十年代在食用菌廣泛研究，但由于在有絲分裂過程中有些染色體 會丟失，融合子不穩定，這種育種技術未得到廣泛應用。
基因工程育種是近年來發展起來的新技術，具有目標明確的特點， 但這一技術在食用菌育種中還處在研究試驗階段，尚未廣泛應用。
雜交育種，國外有用酵母菌與靈芝孢子共培養，培養時間4一6周， 可誘導少量靈芝孢子萌發，萌發率低于1/108。國外的這種方法存在以下 缺點①試驗時間長；②萌發率很低，需要大量的試驗才能獲得可用于 雜交的單孢菌株；◎需要除去酵母菌后才能用于雜交。由于酵母菌的生 長速度遠遠快于靈芝菌絲，如果沒有除去酵母菌，經常會由于酵母菌大量 生長而使靈芝菌絲不生長。
雜交育種是一種有效的品種改良技術，雜交育種可以組合雙親的優 良性狀、表現出雜種優勢，培育出超越親本的雜交種。雜交育種在食用菌 中已廣泛應用，取得很大成效。
現代醫學研究證明，靈芝對治療神經衰弱、慢性支氣管炎、冠心病、 心絞痛及高血脂、高血壓、肝炎、造血系統疾病等有良好的療效。由于含
有靈芝多糖，靈芝可以提高機體免疫功能，增強體質，具有抗腫瘤的作用。
我國靈芝年產量約2000噸，創產值約20億元人民幣，在50多種食用 菌中單種產值最大。但由于我國靈芝人工育種研究相對落后，我國主栽的 品種都是從國外引進或者是從引進品種分離獲得。這種狀況在一定程度上 制約靈芝產業的發展。
鑒于靈芝具有很高的藥用價值，靈芝產業又是一個很大的產業，如 果能建立一種高效的雜交育種技術，將會促進靈芝新品種的培育，進而促 進靈芝產業的進一步發展
發明內容
本發明目的是探索解決靈芝雜交育種中單孢菌株難以 獲得的問題，為靈芝的雜交育種提供一種新方法。
本發明的一種靈芝雜交育種方法，包括靈芝親本菌株選擇、菌絲培養、 再生培養基配制、菌絲裂解、單細胞再生、單核細胞分離、單核體雜交， 雜交菌株培養并篩選，其特征在于
1、 所述菌絲裂解
將經過2次活化、處于生長對數期中期的親本液體菌絲分別放入離心 管中，離心后取沉淀，并加入無菌水清除菌絲外壁的雜質，再用穩滲液清 洗，將清洗后的菌絲懸浮于溶壁酶液，于3(TC的循環水浴鍋中恒溫水浴 至單細胞完全釋放，得單細胞裂解液；所述穩滲液為0.6M甘露醇水溶液； 所述溶壁酶液為含2%溶壁酶的穩滲液。
2、 所述單細胞再生，
離心單細胞裂解液，取沉淀，并用再生培養基清洗沉淀至單細胞外不 含溶壁酶，然后用再生培養基稀釋至單細胞濃度為2 3個/低倍鏡視野， 將單細胞稀釋液涂布至再生培養基平板中，并倒置培養皿于25'C培養箱 中培養，至單細胞開始萌發；
3、 所述單核細胞分離
從單細胞萌發的培養皿中挑取單個已長出芽管的單細胞連同培養基 放入斜面培養基中，于25。C培養，長出3 5cm的菌落時，鏡檢挑取無鎖
狀聯合的菌株，即為單核菌株。
本發明的靈芝雜交育種方法，解決了由于靈芝孢子的細胞壁很厚，
在人工條件下幾乎不萌發，難以進行雜交育種的難題。
本發明的靈芝雜交育種方法，通過菌絲裂解形成單細胞，并萌發成
單核菌株進行雜交育種，整個過程不超過20天即可完成，單核細胞的獲得 率不低于35%，雜交育種的速度快、成功率高。
利用本發明的方法進行靈芝雜交育種，其后代的遺傳性狀穩定，而 無論是誘變育種還是原生質體融合育種所得到的后代，通常遺傳性狀不穩 定。
由于常規的雜交育種需要擔孢子作為原材料，而擔孢子是從靈芝子 實體中彈射而來，因此常規的雜交育種受季節限制， 一年只能做一批；本 發明的雜交育種方法，所用的原材料是靈芝的菌絲，通過液體發酵，幾天 時間就可以得到，不受季節限制， 一個月就可以做幾批次。
具體實施例為了充分公開本發明的靈芝雜交育種方法，以下結合 實施例加以說明。
實施例 一種靈芝雜交育種方法
一種靈芝雜交育種方法，包括以下步驟
1. 親本菌株選擇選取豐產性狀良好的廣東赤芝和靈芝5.75為雜交 親本，轉接到PDA斜面中進行活化兩次；廣東赤芝和靈芝5.75由市場購得。
2. 再生培養基配制(g L-l):葡萄糖10. 0、麥芽糖5. 0、酵母膏5. 0、 氯化鉀44. 73g、固化培養基添加20 g L-l瓊脂；
3. 菌絲培養把經2次活化好的菌種接種至PDA培養基中，放置搖 床中培養7天，培養溫度為25度，轉速為100轉每分鐘；PDA培養基由 市場購得；
4. 菌絲裂解
(1) 把在PDA培養基中已經長成的菌絲移入7ml的離心管中，每管 5ml，赤芝與靈芝5.75各兩管；
(2) 將步驟4 (1)移好菌液的離心管放入高速離心機中10000rpm 離心10min;
(3) 將步驟4 (2)離心過的離心管取出，倒出上清液，加入無菌水， 振蕩后再次放入高速離心機中以10000rmp離心10min;
(4) 將步驟4 (3)離心過的離心管取出，倒出上清液，加入穩滲液 洗漆，振蕩后再次放入高速離心機中離心；
(5) 將步驟4 (4)離心過的離心管取出，用無菌濾紙過濾去溶液后， 將收集的菌絲在無菌濾紙上吸干水份，稱取0.5g菌絲，放入干凈的離心
(6) 稱取100mg溶壁酶加入另一個干凈的離心管，加入5ml穩滲液， 制得溶壁酶液；
(7) 向步驟4 (5)放入菌絲的離心管中加入2. 5ml溶壁酶液，振蕩；
(8) 把步驟4 (7)加入溶壁酶液的離心管放入循環水浴器中3(TC水 浴2.5 3.0h，其間5 10分鐘振蕩一次，至單細胞完全釋放，得單細胞 裂解液；具體方法從離心管中取少量溶液，用血小計數板在顯微鏡下檢 查單細胞數量，至確定單細胞完全釋放。
5. 單細胞再生
(1) 將裝有單細胞裂解液的離心管放入離心機中，于4。C，1000rmp 離心20min;
(2) 將離心過的離心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml穩 滲液洗滌后再放入離心機以4°C， 1000r即離心20min ;
(3) 將步驟5 (2)離心過的離心管取出，倒去上清液，取沉淀，各 加入2ml再生培養基，放入離心機，于4°C， 1000rmp離心20min ;
(4) 將步驟5 (3)離心過的離心管取出，倒去上清液，加入再生培 養基稀釋，稀釋后各取一小滴溶液于載玻片上，蓋上蓋玻片后放上顯微鏡 觀察，使單細胞濃度為2 3個/低倍鏡視野(IOX物鏡)；
(5) 將稀釋后的單細胞液涂平板，每皿涂布0.5ml，倒置平板培養 皿于25'C下培養48小時，單細胞開始萌發。
6. 單核細胞分離
(1) 將平板培養皿放于顯微鏡下尋找已萌發并長出芽管的單細胞， 且周圍其他部分無相同菌絲；
(2) 點燃酒精燈，將接種針于酒精燈上燒紅，在顯微鏡下挑取單個已萌發并長出芽管的單細胞連同一小塊培養基的，并確保培養基上無其他 單細胞；
(3) 在火焰處拔出斜面培養基上的硅膠塞，將挑出的培養基塊放入， 塞回硅膠塞，放于25。C下培養讓其生長；
(4) 當長出3 5cm的菌落時，無菌操作挑取少量菌絲，顯微鏡下檢 查是否有鎖狀聯合，挑取無鎖狀聯合的菌株。
7.單核體雜交將20mlCM培養基裝入干凈的培養皿中，兩個配對菌 株相距lcm接種，25t:下培養7天，當兩個菌株的菌落相互接觸后，挑取 交接處的菌絲，顯微鏡下檢查是否有鎖狀聯合，如果有鎖狀聯合，則說明 雜交成功，如果沒有鎖狀聯合，則說明這兩個菌株不親和，不可雜交。可 雜交的組合轉接到新的CM培養基培養皿，25。C下培養5—7天后，在顯微 鏡下進行單菌絲尖端分離，即得到若干純的雜交菌株。所述CM培養基為 通用的完全培養基，由市場購得。
8.雜交菌株培養并篩選常規方法培養所獲得的雜交菌株，并從中 篩選出雜種優勢強、相對性狀優良的雜交菌株。
利用本發明的方法，從菌株廣東赤芝的單細胞再生平板中分離獲得 79個單個再生菌株，顯微鏡觀察鎖狀聯合結果，有29株無鎖狀聯合，50 株具有典型的鎖狀聯合，菌絲的單核化率為41.4%;從靈芝5.75菌株單 細胞再生平板中分離獲得72個單個再生菌株，通過顯微鏡觀察鎖狀聯合， 其中37株無鎖狀聯合，35株具有典型的鎖狀聯合特征，菌絲的單核化率 為51.4%。通過單核菌株的雜交配對，培養、篩選后得到3個優良的雜 交菌株。
本發明所用的材料與儀器溶壁酶為生物純試劑；酵母膏為化學純試 劑；葡萄糖、麥牙糖和甘露醇為分析純試劑。4K-15型高速冷凍離心機德 國Sigma公司生產；HH-6型水浴鍋由國華電器公司生產；BX51生物顯微 鏡由日本奧林巴斯生產；SW-CJ-1FB型超凈工作臺由蘇州凈化設備有限公 司生產；GSP-9160MBE型恒溫培養箱由上海博迅實業有限公司生產。
權利要求
1、一種靈芝雜交育種方法，包括靈芝親本菌株選擇、菌絲培養、再生培養基配制、菌絲裂解、單細胞再生、單核細胞分離、單核體雜交，雜交菌株培養并篩選，其特征在于(1)所述菌絲裂解，是將經過2次活化、處于生長對數期中期的親本液體菌絲分別放入離心管中，離心后取沉淀，并加入無菌水清除菌絲外壁的雜質，再用穩滲液清洗，將清洗后的菌絲懸浮于溶壁酶液，于30℃的循環水浴鍋中恒溫水浴至單細胞完全釋放，得單細胞裂解液；(2)所述單細胞再生，即離心單細胞裂解液，取沉淀，并用再生培養基清洗沉淀至單細胞外不含溶壁酶，然后用再生培養基稀釋至單細胞濃度為2～3個/低倍鏡視野，將單細胞稀釋液涂布至再生培養基平板中，并倒置培養皿于25℃培養箱中培養，至單細胞開始萌發；(3)所述單核細胞分離，是從單細胞萌發的培養皿中挑取單個已長出芽管的單細胞連同培養基放入斜面培養基中，于25℃培養，長出3～5cm的菌落時，鏡檢挑取無鎖狀聯合的菌株。
2、 根據權利要求1所述的一種靈芝雜交育種方法，其特征在于菌絲 裂解的具體步驟如下(1) 把在PDA培養基中已經長成的菌絲移入7ml的離心管中，每管 5ml，赤芝與靈芝5.75各兩管；(2) 將步驟(1)移好菌液的離心管放入高速離心機中10000rpm離 心lOmin.，(3) 將步驟(2)離心過的離心管取出，倒出上清液，加入無菌水， 振蕩后再次放入高速離心機中以10000rmp離心10min;(4) 將步驟(3)離心過的離心管取出，倒出上清液，加入穩滲液洗 滌，振蕩后再次放入高速離心機中離心；(5) 將步驟(4)離心過的離心管取出，用無菌濾紙過濾去溶液后， 將收集的菌絲在無菌濾紙上吸干水份，稱取0.5g菌絲，放入干凈的離心 管中；(6) 稱取100mg溶壁酶加入另一個干凈的離心管，加入5ml穩滲液，制得溶壁酶液；(7) 向步驟(5)放入菌絲的離心管中加入2.5ml溶壁酶液，振蕩；(8) 把步驟(7)加入溶壁酶液的離心管放入循環水浴器中3(TC水 浴2.5 3.0h，其間5 10分鐘振蕩一次，至單細胞完全釋放，得單細胞 裂解液；具體方法從離心管中取少量溶液，用血小計數板在顯微鏡下檢 査單細胞數量，至確定單細胞完全釋放。
3、 根據權利要求1所述的一種靈芝雜交育種方法，其特征在于單細 胞再生的具體步驟如下(1) 將裝有單細胞裂解液的離心管放入離心機中，于4。C，1000rmp 離心20min;(2) 將離心過的離心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml穩 滲液洗滌后再放入離心機以4°C， 1000rmp離心20min ;(3) 將步驟(2)離心過的離心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加 入2ml再生培養基，放入離心機，于4°C， 1000rmp離心20min ;(4) 將步驟(3)離心過的離心管取出，倒去上清液，加入再生培養 基稀釋，稀釋后各取一小滴溶液于載玻片上，蓋上蓋玻片后放上顯微鏡觀 察，使單細胞濃度為2 3個/低倍鏡視野；(5) 將稀釋后的單細胞液涂平板，每皿涂布0.5ml，倒置平板培養 皿于25。C下培養48小時，單細胞開始萌發。
4、 根據權利要求1所述的一種靈芝雜交育種方法，其特征在于單核 細胞分離的具體步驟如下(1) 將平板培養皿放于顯微鏡下尋找已萌發并長出芽管的單細胞， 且周圍其他部分無相同菌絲；(2) 點燃酒精燈，將接種針于酒精燈上燒紅，在顯微鏡下挑取單個 己萌發并長出芽管的單細胞連同一小塊培養基的，并確保培養基上無其他 單細胞；(3) 在火焰處拔出斜面培養基上的硅膠塞，將挑出的培養基塊放入， 塞回硅膠塞，放于25X:下培養讓其生長；(4) 當長出3 5cm的菌落時，無菌操作挑取少量菌絲，顯微鏡下檢 査是否有鎖狀聯合，挑取無鎖狀聯合的菌株。
全文摘要
一種靈芝雜交育種方法，包括親本菌株選擇、菌絲培養、再生培養基配制、菌絲裂解、單細胞再生、單核細胞分離、單核體雜交，雜交菌株培養并篩選。由于靈芝孢子的細胞壁很厚，在人工條件下幾乎不萌發，難以進行雜交育種，本發明通過菌絲裂解形成單細胞，并萌發成單核菌株進行雜交育種，整個過程不超過20天即可完成，單核細胞的獲得率不低于35％，具有雜交育種的速度快、成功率高、后代遺傳性狀穩定等優點。
文檔編號A01H1/02GK101352144SQ20081007177
公開日2009年1月28日 申請日期2008年9月16日 優先權日2008年9月16日
發明者林俊華, 謝寶貴, 鄧優錦 申請人:福建農林大學