專利名稱：一種抗香蕉枯萎病微生態菌劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵領域，具體涉及一種抗香蕉枯萎病微生態菌劑及其制備方 法。
背景技術：
香蕉枯萎病被稱為香蕉的“癌癥”，是典型的土傳病害，病原菌為古巴尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cubense, FOC)。由于化學防治效果不理想、易產生抗性、污 染環境等缺點，采取生物防治香蕉枯萎病已逐步成為了枯萎病防治的新方向。枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性、好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，其分布廣泛，極 易分離培養，對人畜無毒無害，不污染環境，能產生耐熱抗逆的芽孢。目前該菌已經在黃瓜、 辣椒、水稻、小麥、玉米等農作物上顯出很好的病害防治效果。該菌批量生產工藝簡單，成本 也較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物。目前用枯草芽孢桿菌制備生防制 劑防治植物病害的研究已成為國內外研究的熱點，有關枯草芽孢桿菌在植物生物防治上的 應用報道很多，而發酵條件方面的研究較少。

發明內容
本發明提供了一種抗香蕉枯萎病微生態菌劑及其制備方法，并以提高其抑菌活性 為目標，優化了該枯草芽孢桿菌的液體發酵培養基配方和發酵條件，降低成本，提高效價， 發酵完成后可作為一種抗香蕉枯萎病微生態菌劑，為枯草芽孢桿菌在生物防治方面的進一 步開發和應用提供了依據。本發明的抗香蕉枯萎病微生態菌劑為枯草芽孢桿菌發酵液，該發酵液的發酵培養 基配制為玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10% (重量比);豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10% (重量比)；水1000ml ；PH6-9 ；在121°C下高壓滅菌30min。所述抗香蕉枯萎病微生態菌劑的制備步驟如下 (1)枯草芽孢桿菌液體發酵培養基配制
玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10%(占水的重量比);豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10% (占水的重量比)；水1000ml ；PH6-8 ；在121°C下高壓滅菌30min。(2)枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌菌株活化后接種到細菌液體發酵培養基中，置于25-35°C、100-200r/ min條件下震蕩培養10-50h ；所述細菌液體發酵培養基為牛肉膏-蛋白胨培養基。( 3 )枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將枯草芽孢桿菌種子液接種到枯草芽孢桿菌液體發酵培養基中，接種量1-10% (v/v), 在溫度20-30°C下培養10-50h ；
(4)收集
發酵完成后收集枯草芽孢桿菌發酵液；
(5)檢測
用平板計數法測定生物量，用打孔法檢測抑菌效果。
步驟(2)所述的活化在細菌培養斜面上活化，活化時間24h ；所述細菌培養斜面的 配制如下牛肉膏5 g, NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2。步驟(2)所述接種為菌株活化后挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體發
酵培養基中。本發明的抗香蕉枯萎病微生態菌劑的抑菌效果通過用平板計數法測定生物量，用 打孔法檢測抑菌效果；
所述的打孔法步驟如下
將香蕉枯萎病病原菌以劃線法接種到PDA培養基上，置于26°C下培養9天；從上挑 取1環孢子至10ml無菌水中，混勻，制成病原菌孢子懸液，按體積比1 :100加入冷卻至 40°C -60°C的PDA培養基，倒入培養皿中；待凝固后用打孔器打孔，加入步驟(4)所述枯草芽 孢桿菌發酵液，在26°C培養72h，觀察抑菌圈大小。本發明以發酵后發酵液的抑菌活性高低為標準，綜合了降低成本，節約能源，簡化 環節，提高效率等因素，針對枯草芽孢桿菌的生物學特性，篩選培養溫度、培養條件、發酵溫 度、接種量等。本發明采用的發酵培養基原料經濟便宜，發酵培養基濃度、接種量、裝瓶量適中， 可使發酵后產物具有較高的抗香蕉枯萎病菌活性。采用的發酵培養基配方和發酵條件可使 發酵產物具有良好的抑菌活性，且成本較低；采用的檢測方法快速方便，可獲得直接明了的 檢測結果。本發明的顯著優點
1、常見枯草芽孢桿菌液體發酵所用的培養基大多以牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等為主，生 產成本較高，本發明選用的發酵培養基為淀粉、玉米粉、豆粕、黃豆粉等農產品，容易獲得且 價格經濟便宜；
2、發酵培養基濃度、接種量、裝瓶量適中，可使發酵后產物具有較高的抗香蕉枯萎病菌 活性。3、本發明以發酵后發酵液的抑菌活性高低為標準，綜合了降低成本，節約能源，簡 化環節，提高效率等因素，針對枯草芽孢桿菌的生物學特性，篩選出優化的培養溫度、培養 條件、發酵溫度、接種量等。
具體實施例方式以下為本發明的幾個具體實施案例，進一步描述本發明，但是本發明不僅限于此。實施例1
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
糖蜜0. 5%，牛肉膏1%，水1000ml ；pH7. 5 ；55ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅 菌 30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS12菌株(保存在福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室) 在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于 28°C、160r/min條件下震蕩培養24h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
4將CS12種子液接種到發酵培養基中(接種量5%)，30°C、180r/min條件下震蕩培養50h。4、發酵完成后收集發酵液。5、檢測
平板計數法測定生物量。打孔法檢測抑菌效果將香蕉枯萎病病原菌福建4號生理小種(FJ4)以劃線法接 種到PDA培養基上，置于26°C下培養9天；從上挑取1環孢子至10ml無菌水中，混勻，制成 FJ4孢子懸液，再以1 :100的比例加入熔化后冷卻至45°C左右的PDA中，倒入培養皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS12發酵液，在26°C培養72h，觀察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 徑在19mm-22mm范圍內，說明發酵液具有較高的抑菌活性。6、瓶裝或桶裝成成品。實施例2
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
玉米粉0. 5%，豆粕1%，水1000ml ；pH7. 0 ；50ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅 菌 30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS18菌株(保存在福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室) 在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于 30°C、180r/min條件下震蕩培養24h。4、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS18種子液接種到發酵培養基中(接種量4%)，30°C、180r/min條件下震蕩培養10h。5、發酵完成后收集發酵液。6、檢測
平板計數法測定生物量。打孔法檢測抑菌效果將香蕉枯萎病病原菌福建4號生理小種(FJ4)以劃線法接 種到PDA培養基上，置于26°C下培養9天；從上挑取1環孢子至10ml無菌水中，混勻，制成 FJ4孢子懸液，再以1 :100的比例加入熔化后冷卻至45°C左右的PDA中，倒入培養皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS18發酵液，在26°C培養72h，觀察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 徑在19mm-22mm范圍內，說明發酵液具有較高的抑菌活性。實施例3
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
蔗糖0. 4%，黃豆粉1. 2%，水1000ml ；pH7. 6 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓 滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株(保存在福建省農科院土壤肥料研究所農業微生物研究室) 在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體培養基中，置于 30°C、180r/min條件下震蕩培養28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS16種子液接種到發酵培養基中(接種量6%)，20°C、200r/min條件下震蕩培養25h。4、發酵完成后收集發酵液。
5、檢測
平板計數法測定生物量。打孔法檢測抑菌效果將香蕉枯萎病病原菌福建4號生理小種(FJ4)以劃線法接 種到PDA培養基上，置于26°C下培養9天；從上挑取1環孢子至10ml無菌水中，混勻，制成 FJ4孢子懸液，再以1 :100的比例加入熔化后冷卻至45°C左右的PDA中，倒入培養皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS16發酵液，在26°C培養72h，觀察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 徑在19mm-22mm范圍內，說明發酵液具有較高的抑菌活性。實施例4
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
玉米粉10%，豆粕9%，水1000ml ；pH8 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三 角瓶細菌液體培養基中，置于35°C、180r/min條件下震蕩培養28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS16種子液接種到發酵培養基中(接種量10%)，28°C、200r/min條件下震蕩培養
50h。4、發酵完成后收集發酵液。實施例5
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
玉米粉5%，豆粕6%，水1000ml ；pH6 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三 角瓶細菌液體培養基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS16種子液接種到發酵培養基中(接種量1%)，28°C、200r/min條件下震蕩培養24h。4、發酵完成后收集發酵液。實施例6
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
玉米粉0. 1%，豆粕1%，水1000ml ；pH6. 5 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅 菌 30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三 角瓶細菌液體培養基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS16種子液接種到發酵培養基中(接種量1%)，28°C、200r/min條件下震蕩培養10h。4、發酵完成后收集發酵液。實施例71、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
淀粉1%，豆粕1%，水1000ml ；pH6. 5 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三 角瓶細菌液體培養基中，置于28°C、180r/min條件下震蕩培養28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS16種子液接種到發酵培養基中(接種量1%)，26°C、200r/min條件下震蕩培養20h。4、發酵完成后收集發酵液。實施例8
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
糖蜜1%，麩皮5%，水1000ml ；pH7 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三 角瓶細菌液體培養基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS16種子液接種到發酵培養基中(接種量1%)，29°C、200r/min條件下震蕩培養30h。4、發酵完成后收集發酵液。實施例9
1、枯草芽孢桿菌發酵培養基制備
蔗糖0. 5%，豆粕5%，水1000ml ；pH6 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細菌培養斜面上活化24h，挑兩環接種到50ml/250ml的三 角瓶細菌液體培養基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發酵
將CS16種子液接種到發酵培養基中(接種量1%)，27°C、200r/min條件下震蕩培養18h。4、發酵完成后收集發酵液。
權利要求
一種抗香蕉枯萎病微生態菌劑，其特征在于所述抗香蕉枯萎病微生態菌劑為枯草芽孢桿菌發酵液，該發酵液的發酵培養基配制為玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1 10%(重量比)；豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1 10%(重量比)；水1000ml；pH6 9；在121℃下高壓滅菌30min。
2.一種抗香蕉枯萎病微生態菌劑的制備方法，其特征在于所述制備方法的具體步驟 如下(1)枯草芽孢桿菌液體發酵培養基配制玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10% (重量比)；豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10% (重 量比)；水1000ml ；PH6-9 ；在121°C下高壓滅菌30min ；(2)枯草芽孢桿菌種子液制備將枯草芽孢桿菌菌株活化后接種到細菌液體發酵培養基中，置于25-35°C、100-200r/ min條件下震蕩培養10-50h ；所述細菌液體發酵培養基為牛肉膏-蛋白胨培養基；(3)枯草芽孢桿菌搖瓶發酵將枯草芽孢桿菌種子液接種到枯草芽孢桿菌液體發酵培養基中，接種量1-10% (v/v), 在溫度20-30°C下培養10-50h ；(4)收集發酵完成后收集枯草芽孢桿菌發酵液即為抗香蕉枯萎病微生態菌劑。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的活化是在細菌培養斜 面上活化，活化時間24h。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述細菌培養斜面的配制如下牛肉 膏 5 g, NaCl 5 g，蛋白胨 10 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.2。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述接種為菌株活化后挑兩 環接種到50ml/250ml的三角瓶細菌液體發酵培養基中。
全文摘要
本發明提供了一種抗香蕉枯萎病微生態菌劑及其制備方法。所述抗香蕉枯萎病微生態菌劑發酵液的發酵培養基為玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10%；豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10%；水1000ml；pH6-9。通過制備枯草芽孢桿菌種子液，接種到發酵培養基中培養；發酵完成后收集枯草芽孢桿菌發酵液。本發明采用的發酵培養基原料經濟便宜，發酵培養基濃度、接種量、裝瓶量適中，可使發酵后產物具有較高的抗香蕉枯萎病菌活性。采用的發酵培養基配方和發酵條件可使發酵產物具有良好的抑菌活性，且成本較低；采用的檢測方法快速方便，可獲得直接明了的檢測結果。
文檔編號A01P3/00GK101911954SQ201010274100
公開日2010年12月15日 申請日期2010年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者張慧, 林戎斌, 林新堅, 林陳強, 白丹紅, 蔡海松, 陳濟琛 申請人:福建省農業科學院土壤肥料研究所