專利名稱：一種藥用細胞注射液的凍存保護輔料的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，特別是藥品的輔料，也涉及生物制品的玻璃化凍存技術，具體涉及一種藥用細胞注射液的凍存保護輔料，通過在藥用細胞制品中添加聚乙二醇、 1，2_丙二醇、白蛋白、氯化鈉等凍存保護劑實現藥用細胞制品的玻璃化凍存，提高解凍后的復蘇率，并且安全無毒，實現藥用細胞制品解凍后直接臨床使用，此外該輔料還具有補充營養、增強免疫力、增強細胞治療效果的功能。
背景技術：
細胞治療又稱活細胞治療，是指用活細胞修復病變或損傷的組織。細胞治療中使用的細胞可以有多種來源，根據對國家藥監局網站的檢索，目前我國進入臨床試驗的細胞治療產品有骨髓間充質干細胞、臍帶血巨核系祖細胞、臍帶血紅系祖細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)等；根據衛生部2009年頒布的《首批允許臨床應用的第三類醫療技術目錄》，細胞移植治療技術(干細胞除外)、造血干細胞治療技術已經被允許應用于臨床。此外國內外還有神經干細胞、胚胎干細胞、視網膜色素上皮細胞等多種細胞作為藥物或醫療技術進入臨床試驗或動物試驗。由于細胞治療要使用活細胞，藥用細胞制品在儲存過程中必須保持細胞的活性。 傳統的長期儲存方法是在細胞制品中加入10%左右的DMSO作為低溫保護劑，然后凍存于-196°C液氮或_80°C超低溫冰箱中。然而DMSO具有很高的毒副作用，通常使接受移植的個體產生惡心、嘔吐、腹痛等癥狀，對心血管、呼吸系統、中樞神經以及腎臟等也會產生副作用。使用DMSO作為凍存劑時，在細胞解凍復蘇后進行一段時間的馴化培養后再進行細胞移植才比較安全。因此尋找一種毒副作用小、細胞解凍后能夠直接移植的凍存保護劑非常重要。玻璃化方法是在完全玻璃化狀態下保存生物材料的一種方法。玻璃化是指液態轉變為非晶態的固化過程，玻璃態固體能保持液態時正常的分子和離子分布，可以避免因結冰對生物材料造成的物理性損傷。玻璃化方法操作簡單快速，對細胞、組織損傷小，是一種非常有前景的生物材料的長期保存方法。本發明提供了一種新的藥用級細胞注射液的凍存保護輔料，包括聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白、氯化鈉等成分。該細胞注射液的凍存保護輔料可以有效形成細胞或組織的低溫玻璃化長期凍存效果，并且使用該輔料凍存的細胞注射液解凍后能夠直接移植，具有安全、方便、快捷等特點，此外還具有補充營養、增強免疫力、 增強細胞治療效果的功能，更適于細胞治療。

發明內容
本發明的目的在于針對細胞治療的特殊需求，提供一種藥用細胞注射液的凍存保護輔料，使細胞治療更加安全、方便、快捷。本發明涉及一種藥用的生物組織樣本，例如，細胞注射液的凍存保護輔料，其含有聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分。在具體的實施方案中，所述聚乙二醇在所述
3生物組織樣本，例如細胞注射液中的終濃度為5-100g/L、25-100g/L、50-100g/L、75-100g/ L、80-100g/L、90-100g/L;所述1，2-丙二醇在所述生物組織樣本，例如細胞注射液中的終濃度為 50-400g/L、100-400g/L、150-400g/L、200-400g/L、250-400g/L、300-400g/L ；所述白蛋白在所述生物組織樣本，例如細胞注射液中的終濃度為10-100g/L、30-100g/L、 50-100g/L、70-100g/L、80-100g/L、90-100g/L ；所述氯化鈉在所述生物組織樣本，例如細胞注射液中的終濃度為 8. 5-9. 5g/L、8. 6-9. 4g/L、8. 7-9. 3g/L、8. 8-9. 2g/L、8. 9-9. lg/L、9g/ L。以上所列聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分的終濃度范圍可以任意組合，配制成本發明的藥用細胞注射液的凍存保護輔料。例如，在一個實施方案中，所述聚乙二醇、1， 2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分在所述細胞注射液中的終濃度為聚乙二醇(PEG)，5-100g/L；1，2_ 丙二醇，50-400g/L ；白蛋白，10-100g/L;氯化鈉，8.5_9.5g/L。優選，所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉在所述細胞注射液中的終濃度為聚乙二醇，50_100g/L，1,2-丙二醇，100_400g/L，白蛋白，50_100g/L，氯化鈉，8.5_9.5g/L。更優選，所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉在所述細胞注射液中的終濃度為聚乙二醇，80_100g/L，1,2-丙二醇，200_400g/L，白蛋白，80_100g/L，氯化鈉，9g/L。配制本發明的凍存保護輔料所采用的所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白、氯化鈉優選均為藥用級產品；所述的白蛋白優選是人血白蛋白或稱為人血清白蛋白；所述的聚乙二醇優選是分子量為400的聚乙二醇(PEG400)。本發明的細胞注射液的凍存保護輔料可以用作細胞注射液的凍存保護劑，還可以用做生物組織樣本玻璃化凍存的保護劑。本發明涉及一種生物組織樣本凍存保護劑，含有聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分。在一個實施方案中，所述成分在所述生物組織樣本中的終濃度分別為聚乙二醇(PEG)，5-100g/L；1，2_ 丙二醇，50_400g/L ；白蛋白，10-100g/L;氯化鈉，8.5_9.5g/L。優選，所述成分在所述生物組織樣本中的終濃度為聚乙二醇，50_100g/L，1，2-丙二醇，100_400g/L，白蛋白，50_100g/L，
氯化鈉，8.5_9.5g/L。更優選，所述成分在所述生物組織樣本中的終濃度為聚乙二醇，80_100g/L，1，2-丙二醇，200_400g/L，白蛋白，80_100g/L，氯化鈉，9g/L。在以上實施方案中，所述的白蛋白是人血白蛋白；所述的聚乙二醇是分子量為 400的聚乙二醇(PEG400)。以上所述的生物組織樣本優選為用于細胞移植的新鮮分離后的細胞懸液或凍存復蘇后的細胞懸液等等。術語“細胞治療”或稱為“活細胞治療”，是指將活性細胞注入體內，刺激退化、衰老、損傷細胞，促進其更新、修復，從而恢復器官功能。根據尼漢斯醫生證明的理論，這些細胞從注射的位置開始循環，甚至它們識別出與其來源器官相似的器官，并在其上聚集，例如，肝臟細胞進入肝臟、性細胞移至性器官、心臟細胞進入心臟等等。目前國內外骨髓間充質干細胞、臍帶血巨核系祖細胞、神經干細胞、胚胎干細胞、視網膜色素上皮細胞等多種細胞作為藥物已進入臨床試驗或動物試驗。在活細胞的臨床應用中，保持細胞的活性是至關重要的。本發明的細胞注射液凍存保護輔料能夠使復溶的細胞注射液在90小時和30天后活細胞的數量仍保持在85%以上。同時，本發明的凍存保護輔料通過動物實驗證明也是安全的。“玻璃化”凍存是指在降溫過程中，不產生冰晶，而使溶液固化的過程。它與常見的液體變晶體或部分結晶的凍結過程不同。在本發明的輔料中，聚乙二醇和白蛋白起非滲透性凍存保護作用，能夠深入細胞內部，具有降低冰點、減少冰晶形成、稀釋溶液中電解質的濃度、減少溶質損傷、平衡細胞內外滲透壓、減輕細胞縮水程度等作用。1，2_丙二醇和氯化鈉起滲透性凍存保護作用。上述成分聯合使用，產生了顯著的協同效果，迫使某些熱力學參數發生了改變，比如玻璃化溫度升高、玻璃化所需濃度降低，提高了保存效果，實現了細胞注射液的低溫玻璃化長期凍存。本發明上述輔料中的各成分均是常用的化學試劑或生物制品，其中聚乙二醇可購自青島天力源生物科技有限公司，1，2_丙二醇可購自錦化化工(集團)有限責任公司，白蛋白可購自上海生物制品所，氯化鈉可以生理鹽水的形式購自吉林都邦藥業股份有限公司。
具體實施例方式(1)配置輔料將聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白、氯化鈉各輔料成分按照前述濃度添加到水中溶解，或者將聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白各輔料成分按照前述濃度添加到生理鹽水中溶解，制成輔料溶液；(2)制備注射液將培養液中的細胞放到離心管中離心，棄上清，將步驟(1)制備的輔料溶液添加到離心管中，重懸細胞，使細胞在溶液中的濃度達到1. OX 10~6個細胞/ ml，制成藥用細胞注射液；(3)凍存將步驟(2)制備的藥用細胞注射液按照“4°C 1小時一-200C 1小時 —-700C 10小時一液氮長期儲存”的步驟儲存于液氮中；(4)復溶使用前，將步驟(3)中儲存的藥用細胞注射液從液氮中取出，放置于
535°C中復溶，然后用于細胞移植。實施例1 (1)按照下面的配方配置IOOml輔料溶液
權利要求
1.一種藥用細胞注射液的凍存保護輔料，含有聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化鈉成分。
2.權利要求1的細胞注射液的凍存保護輔料，其中所述成分在所述細胞注射液中的終濃度分別為聚乙二醇(PEG)，5-100g/L ； 1，2-丙二醇，50-400g/L; 白蛋白，10-100g/L;氯化鈉，8. 5-9. 5g/L。
3.權利要求1或2的細胞注射液的凍存保護輔料，其中所述成分在所述細胞注射液中的終濃度分別為聚乙二醇， 50-100g/L， 1,2-丙二醇，100-400g/L， 白蛋白，50-100g/L，氯化鈉，8. 5-9. 5g/L。
4.權利要求1-3任一項的細胞注射液的凍存保護輔料，其中所述成分在所述細胞注射液中的終濃度分別為聚乙二醇， 80-100g/L， 1,2-丙二醇，200-400g/L， 白蛋白，80-100g/L，氯化鈉，9g/L。
5.權利要求1-4任一項所述的細胞注射液的凍存保護輔料，其中所述的白蛋白是人血白蛋白。
6.權利要求1-5任一項所述的細胞注射液的凍存保護輔料，其中所述的聚乙二醇是分子量為400的聚乙二醇(PEG400)。
7.權利要求1-6任一項所述的細胞注射液的凍存保護輔料，其還可以用做生物組織樣本玻璃化凍存的保護劑。
8.權利要求1-6任一項所述的細胞注射液的凍存保護輔料，其為生物組織樣本凍存保護劑。
9.權利要求1-8任一項所述的凍存保護輔料在細胞注射液凍存或生物組織樣本玻璃化凍存方面的用途。
全文摘要
本發明提供了一種藥用細胞注射液的凍存保護輔料，包括一定含量的聚乙二醇、丙二醇、白蛋白、氯化鈉。該輔料還可以用作生物組織樣本玻璃化凍存的保護劑。該輔料在藥用細胞注射液凍存、復蘇過程中能夠減輕對細胞的傷害、維持細胞活性，含有該輔料的藥用細胞注射液可實現低溫玻璃化長期凍存，解凍后可直接用于細胞移植，具有使用安全、方便、快捷等特點。此外，該輔料還具有補充營養、增強免疫力、增強細胞治療效果的功能，更適于細胞治療。
文檔編號A01N1/02GK102273438SQ20111023198
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月15日 優先權日2011年8月15日
發明者劉軍, 楊立敏, 金宜強 申請人:上海安集協康生物技術有限公司