專利名稱：一種防治香蕉枯萎病的不吸水鏈霉菌株bwl58及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及一種防治香蕉枯萎病的菌株及其應(yīng)用，具體涉及一種防治香蕉枯萎病的不吸水鏈霉菌株BWL58及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一種香蕉生產(chǎn)上的毀滅性土傳病害。該病原菌有4個生理小種，在我國分布的是1 號和4號兩個生理小種，對我國香蕉產(chǎn)業(yè)危害最大的是4號生理小種，目前已在海南、廣東、 云南、福建大部分香蕉種植區(qū)大面積發(fā)生，發(fā)病面積已超過50萬畝。廣東和海南香蕉枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的地方已不能再規(guī)?；N植香蕉，不得不改種其它作物。香蕉枯萎病菌是土壤習(xí)居菌，它從香蕉的根部侵入，沿維管束往上擴散蔓延，堵塞導(dǎo)管，產(chǎn)生毒素，破壞維管束的水分和養(yǎng)分的輸送功能，從而使香蕉植株的地上部分得不到水分和養(yǎng)分而發(fā)黃枯萎。病原菌的厚垣孢子可在土壤中存活10多年，是一種積年流行的病害。由于香蕉枯萎病病原菌在維管束內(nèi)擴展侵染，至今尚無十分有效的化學(xué)藥劑防治和高抗枯萎病品種。因此，生物防治受到廣泛關(guān)注。已報道或申請專利的香蕉枯萎病生物防治措施，大部分是采用芽孢桿菌作為生防菌株，這類菌株作為生防菌有許多優(yōu)點，但也存在一個嚴(yán)重不足，即菌株本身對病原菌的拮抗能力不強，從而有可能影響其生防效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種防治香蕉枯萎病的不吸水鏈霉菌株BWL58，該菌株對香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力強，由于菌株本身分離自植物根際土壤，是土壤習(xí)居菌，根際定殖能力強，生防效果良好。本發(fā)明的第二個目的在于提供上述不吸水鏈霉菌株BWL58在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種含有上述不吸水鏈霉菌株BWL58的制劑。本發(fā)明的第四個目的在于提供上述制劑的制備方法，該制備方法工藝簡單，發(fā)酵培養(yǎng)基無需貴重原料，成本低，容易推廣。本發(fā)明的最后一個目的在于提供上述制劑在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)手段來實現(xiàn)的一種防治香蕉枯萎病的不吸水鏈霉菌株BWL58，該菌株BWL58的分類命名為不吸水鏈霉菌(Str印tomyces ahygroscopicus)，于2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4837。該菌株的16S rDNA部分基因序列(1491bp)已提交美國國家生物技術(shù)信息中心 (NCBI)的Genebank基因序列數(shù)據(jù)庫，登錄號為JN038326，該菌株BWL58的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
本發(fā)明的第二個技術(shù)方案是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的上述不吸水鏈霉菌株 BWL58在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個技術(shù)方案是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種防治香蕉枯萎病的制劑，含有上述菌株BWL58的液體菌劑或固體菌劑。本發(fā)明的第四個技術(shù)方案是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的上述防治香蕉枯萎病的制劑的制備方法，將上述不吸水鏈霉菌株BWL58經(jīng)含菌種活化、液體或固體發(fā)酵工序制備獲得液體菌劑或固體菌劑。其中，上述防治香蕉枯萎病的制劑的制備方法中，還可以含有種子培養(yǎng)工序，即將上述不吸水鏈霉菌株BWL58經(jīng)含菌種活化、種子培養(yǎng)、液體或固體發(fā)酵工序制備獲得液體菌劑或固體菌劑。 具體來說，本發(fā)明中的液體菌劑可以通過以下工藝流程獲得的菌種BWL58活化 (即一級種子培養(yǎng))一菌種培養(yǎng)(即二級種子培養(yǎng)，可選)一液體發(fā)酵(發(fā)酵罐，無菌空氣， 培養(yǎng)液)一液體菌劑。其中液體培養(yǎng)基中液體發(fā)酵時采用的培養(yǎng)基可以包括葡萄糖1_3%、黃豆餅粉 1-4%、可溶性淀粉 1-4%、酵母膏 0. 2%, NaCl 0.4%, CaCO3O. 25%、消泡劑 0. 1-0. 3%，按質(zhì)量百分含量計，其余為水。以上為本發(fā)明優(yōu)選的培養(yǎng)基，實際上本發(fā)明對培養(yǎng)條件和液體培養(yǎng)基并沒有特別嚴(yán)格的限制，只要該條件和液體培養(yǎng)基適合菌株的生長即可。具體來說，本發(fā)明中的固體菌劑可以通過如下工藝流程獲得菌種BWL58活化(即一級種子培養(yǎng))一菌種培養(yǎng)(即二級種子培養(yǎng)，可選)一固體培養(yǎng)基質(zhì)一發(fā)酵餅(固體發(fā)酵)一干燥粉碎，干燥粉碎后獲得的發(fā)酵餅與吸附載體按1 1或者其它比例混合，混勻后適當(dāng)干燥，制成固體菌劑。其中吸附載體可為高嶺土、非耕作層土等多種載體。其中固體發(fā)酵時采用的固體培養(yǎng)基優(yōu)選為包括大米60-70 %，黃豆粉5-15 %，麥皮10-20%，沙土 5-10%，以上按質(zhì)量百分含量計。以上為本發(fā)明優(yōu)選的固體培養(yǎng)基，實際上本發(fā)明對培養(yǎng)條件以及固體培養(yǎng)基的選擇其實并沒有特別嚴(yán)格的限制，只要該條件和固體培養(yǎng)基適合菌株的生長即可。本發(fā)明的最后一個目的是通過如下技術(shù)手段來實現(xiàn)的上述制劑在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明中的固體菌劑防治香蕉枯萎病時，可以將液體菌劑或固體菌劑與普通有機肥按2 100(質(zhì)量比)或者其它的比例混合拌勻后作為底肥施用，每個定植穴施2-3公斤， 在香蕉種植前施用；在香蕉種植后的生長期，可將液體菌劑或者固體菌劑以稀釋5-10倍的比例加入到溶解的常規(guī)肥料中，對香蕉植株進行澆灌施肥?；蛘弑景l(fā)明中的液體菌劑防治香蕉枯萎病可以通過將發(fā)酵液稀釋成2倍或根據(jù)需要進行稀釋后液灌根或澆施于植株基部，或于香蕉苗移栽前浸根。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明以不吸水鏈霉菌BWL58作為拮抗菌株，對香蕉枯萎病菌抑制作用強，對香蕉枯萎病具有良好的防治效果；(2)本發(fā)明的制劑可刺激香蕉根系生長并促進香蕉幼苗的生長，對香蕉具有促生長作用；(3)本發(fā)明的不吸水鏈霉菌菌株BWL58培養(yǎng)條件簡單，容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景；(4)本發(fā)明制防治香蕉枯萎病的劑制備方法工藝簡單，發(fā)酵培養(yǎng)基無需貴重原料， 成本低，容易推廣。


圖1是實施例1中篩選得到的不吸水鏈霉菌BWL58菌株的孢子及孢子鏈的掃描電鏡照片，孢子表面有短刺；圖2是實施例1中制備的不吸水鏈霉菌BWL58菌株與香蕉枯萎病菌的室內(nèi)平板對峙培養(yǎng)的抑菌效果，香蕉枯萎病菌4號生理小種受到不吸水鏈霉菌BWL58菌株的抑制后菌絲尖端膨大、變黑、細胞質(zhì)液外泄，1為不吸水鏈霉菌BWL58菌株，2為香蕉枯萎病菌4號生理小種。
具體實施例方式實施例1菌株的分離和鑒定本發(fā)明中的生防菌是從海南島霸王嶺原始森林土壤中篩選分離到的一株鏈霉菌， 該菌株對香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)具有強烈的抑制作用，該菌株于2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 4837，分類命名為不吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces ahygroscopicus)。菌株BWL58的分離篩選過程如下從在海南島霸王嶺原始森林中采集植物根際土壤，然后對土樣進行風(fēng)干，用無菌水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布于篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)基是添加重鉻酸鉀、萘啶酸和放線菌酮的PDA固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)5天以上，待篩選平板上長出放線菌菌落后，再于平板上適當(dāng)位置接入1個或多個指示菌香蕉枯萎病菌菌餅，當(dāng)某個放線菌落具有拮抗作用時，指示菌便不能越過此放線菌生長，呈現(xiàn)明顯的拮抗帶，挑取具有拮抗作用的放線菌，劃線純化三次，進行平板對峙實驗，選擇拮抗帶較寬的放線菌作為候選菌株，將候選菌株進行液體發(fā)酵，取發(fā)酵液IOmL過濾除菌，用牛津杯進行平板對峙實驗檢驗發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生情況，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的發(fā)酵液再于香蕉枯萎病病圃中進行田間防效篩選，由此篩選出田間防治效果良好的拮抗菌株BWL58。菌株BWL58的鑒定過程如下首先對其進行16S rDNA序列分析，將該菌株的16S rDNA 序列在線提交至Ij gene bank (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)中進 亍 Blast 比對，發(fā)現(xiàn)其與不吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces ahygroscopicus)處于同一個進化分支，同源性達99%以上。本菌株的16S rDNA序列部分基因序列(1491bp)已提交美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Genebank基因序列數(shù)據(jù)庫，登錄號為JN038326，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。然后對BWL58菌株進行形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征和生理生化特性分析鑒定，經(jīng)分析其形態(tài)特征是在掃描電鏡下孢子絲呈長螺旋形，2-6圈，孢子大部分球形至橢圓形，表面有細刺(見圖1)；在營養(yǎng)瓊脂平板上有豐富的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，氣絲灰白色，基絲欖黃色，無可溶性色素，能液化明膠，淀粉水解強，不利用纖維素，還原硝酸鹽，不產(chǎn)硫化氫和黑色素，利用尿素，能利用果糖、鼠李糖、甘露糖、甘油、乳糖、菊糖、葡萄糖、肌醇、 甘露醇、麥芽糖、糊精、淀粉、山梨糖，不利用棉子糖、木糖、水楊苷、衛(wèi)矛醇，在阿拉伯糖、蔗糖、半乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基質(zhì)上生長差。本菌株的形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征與不吸水鏈霉菌完全相同，生理生化特性絕大部分與不吸水鏈霉菌相同。因此，綜合16S rDNA序列的比對結(jié)果和形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性分析的結(jié)果，將BWL58菌株鑒定為不吸水鏈霉菌，命名為不吸水鏈霉菌BWL58菌株(Streptomyces ahygroscopicus BWL58)。該菌株抑菌能力和根際定殖能力強，可在香蕉的根際定殖，在平板對峙實驗中抑菌圈直徑平均為18mm，指示菌香蕉枯萎病菌菌絲尖端膨大，變黑，細胞質(zhì)液外泄(見圖2所示)，說明該菌株的代謝產(chǎn)物對古巴尖孢鐮刀菌菌絲有殺死作用和很強的抑制作用。實施例2液體菌劑及其制備方法本實施例提供的含有上述菌株BWL58的液體菌劑通過如下方法制備獲得(1)菌種活化，將菌株BWL58接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；(2)種子培養(yǎng)，將活化菌種接種到液體培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分含量計，配方為葡萄糖 2 %，黃豆餅粉 1 %，酵母膏 0.2%，NaCl 0.3%，CaCO3O. 1 %，K2HPO4O. 05 %，其余為水；pH 值7. 0-7. 2 ；在28°C下三角瓶160轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72小時，實際上，如步驟(1)中制備的菌種足夠多，則可以不用再經(jīng)種子培養(yǎng)工序，直接進行液體發(fā)酵即可；(3)液體發(fā)酵，將種子液按6% (體積百分含量)添加到液體培養(yǎng)基中，配方為葡萄糖2%、黃豆餅粉1 %、可溶性淀粉2%、酵母膏0.2%、NaCl 0.4%, CaCO3O. 25%、消泡劑 0. 1 %，按質(zhì)量百分含量計，其余為水，本實施例中采用的為較佳的培養(yǎng)基，其它培養(yǎng)基也可以，并無特別的限制，PH值7. 2，罐溫28°C，罐壓0. 07Mpa,攪拌速度200rpm，通氧量> 60%， 發(fā)酵時間約7天，獲得液體發(fā)酵制劑，供田間防治病害用。實施例3固體菌劑及其制備方法本實施例提供的含有上述菌株BWL58的固體菌劑通過如下方法制備獲得(1)菌種活化將菌株BWL58接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；(2)種子培養(yǎng)將活化菌種接種到液體培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分含量計，配方為葡萄糖1%，黃豆餅粉1%，大豆蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，NaCl 0.3%，CaCO3O. 1%, K2HPO4O. 05%，其余為水，本實施例中采用的為較佳的培養(yǎng)基，其它培養(yǎng)基也可以，并無特別的限制；PH值7. 0-7. 2 ；在28°C下三角瓶160轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72小時，實際上，如步驟(1)中制備的菌種足夠多，則可以不用再經(jīng)種子培養(yǎng)工序，直接進行固體發(fā)酵即可；(3)固體培養(yǎng)將種子培養(yǎng)液與固體培養(yǎng)基混合，按質(zhì)量百分含量計，固體培養(yǎng)基配方為大米65 %，黃豆粉5%，麥皮20%，沙土 10%，以上按質(zhì)量百分含量計，此處固體培養(yǎng)基的配比為優(yōu)選，其它配比也可以，無特殊要求，28°C -30°C培養(yǎng)時間14天左右，此時固體培養(yǎng)基應(yīng)充分生長且大量產(chǎn)孢；(4)菌劑制備將已充分發(fā)酵的固體培養(yǎng)基質(zhì)干燥粉碎，與高嶺土或非耕作層土按11混勻后即制成固體菌劑。實施例4液體菌劑和固體菌劑對香蕉枯萎病田間防治效果試驗用菌劑實施例2中制備的不吸水鏈霉菌株BWL58液體菌 劑，實施例3中制備的白刺鏈霉菌BWL58固體菌劑，清水對照；
試驗地點中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所?？谙憬犊菸〔∑?；供試香蕉品種感枯萎病品種巴西蕉。施藥方法定植穴預(yù)處理用上述含不吸水鏈霉菌株BWL58菌株的液體菌劑2倍稀釋液IL澆淋定植穴，然后覆蓋薄土；BWL58菌株固體菌劑與有機肥按1 1混合后，每個定植穴放用 2-3公斤，與穴內(nèi)土壤充分拌勻。香蕉苗預(yù)施菌劑處理移栽前一天，將香蕉苗用含有不吸水鏈霉菌BWL58菌株液體菌劑的2倍稀釋液浸根；固體菌劑稀釋5倍后用于香蕉苗浸根。移栽將浸根后的香蕉苗移栽于處理過的定植穴中。管理定期施肥，液體菌劑處理每月用液體菌劑的5倍稀釋液2L灌根一次，固體菌劑處理每月用固體菌劑的5倍稀釋液灌根一次，6個月后記錄植株病情指數(shù)、發(fā)病率，并計算防治效果。發(fā)病率％=發(fā)病株(葉)數(shù)X 100/調(diào)查總株(葉)數(shù)病情指數(shù)％ =[(各級病株(葉)數(shù)X該病級值)/調(diào)查總株(葉)數(shù)X最高級值防治效果％ =(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))X 100/對照病情指數(shù)香蕉枯萎病病情調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)0級外觀無可見癥狀，解剖假莖維管束組織未見變褐，1級外觀無可見癥狀，解剖假莖維管束組織變褐，2級葉片黃化或倒垂，3級假莖基部開裂，但病株尚未枯死，4級病株枯死。試驗結(jié)果對照區(qū)在香蕉苗定植后40天開始出現(xiàn)香蕉枯萎病癥狀，經(jīng)不吸水鏈霉菌BWL58 菌株發(fā)酵液處理或固體制劑處理的香蕉在處理120天后均沒有植株表現(xiàn)枯萎病癥狀，6個月后的防治效果，BWL58菌株發(fā)酵液處理為82% (詳見表1)，BWL58菌株固體制劑處理為 79. 5% (詳見表2)，表明BWL58菌株無論是發(fā)酵液還是固體制劑都對香蕉枯萎病具有良好的防治效果。表1不吸水鏈霉菌BWL58菌株發(fā)酵液對香蕉枯萎病的防治效果調(diào)查統(tǒng)計表
權(quán)利要求
1.一種防治香蕉枯萎病的不吸水鏈霉菌株BWL58，其特征是該菌株BWL58的分類命名為不吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces ahygroscopicus)，于2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4837。
2.權(quán)利要求1所述的菌株BWL58在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。
3.一種防治香蕉枯萎病的制劑，其特征是含有權(quán)利要求1所述的不吸水鏈霉菌株 BWL58的液體菌劑或固體菌劑。
4.權(quán)利要求3所述制劑的制備方法，其特征是將權(quán)利要求1所述的不吸水鏈霉菌株 BWL58經(jīng)含菌種活化、液體或固體發(fā)酵工序制備獲得液體菌劑或固體菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制劑的制備方法，其特征是還包括種子培養(yǎng)工序。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制劑的制備方法，其特征是液體發(fā)酵時采用的培養(yǎng)基包括葡萄糖1-3%、黃豆餅粉1_4%、可溶性淀粉1-4%、酵母膏0. 2%,NaClO. 4%,CaCO3O. 25%、消泡劑0. 1-0. 3%，按質(zhì)量百分含量計，其余為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述制劑的制備方法，其特征是固體發(fā)酵時采用的固體培養(yǎng)基包括大米60-70 %，黃豆粉5-15 %，麥皮10-20 %，沙土 5_10 %，以上按質(zhì)量百分含量計。
8.權(quán)利要求3所述的制劑在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治香蕉枯萎病的不吸水鏈霉菌株BWL58，該菌株BWL58的分類命名為不吸水鏈霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)，于2011年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4837；該菌株對香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力強，可用于防治香蕉枯萎?。贿€公開了含有該菌株的菌劑及其制備方法和應(yīng)用，該菌劑不僅能抑制香蕉枯萎病，還對植株有一定的促生長作用。
文檔編號A01P3/00GK102329755SQ201110296029
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者曾會才, 曾濤, 李戈, 莫坤聯(lián), 陳漢清 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實驗站