專利名稱：一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種利用金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法。
背景技術(shù)：
金線蓮[Ancwctochilusroxburghii (Wall. ) Lindl.]為蘭科開唇蘭屬(金線蓮屬)多年生草本植物。該屬植物有40多種，分布于亞洲熱帶地區(qū)至大洋洲，我國20種，2個變種。金線蓮為名貴中草藥，享有“藥王”、“金草”、“神藥”、“烏人參”等美譽，在我國經(jīng)典醫(yī)學書籍《本草求源》和《國藥大藥典》等均有記載。金線蓮種子在自然條件下萌發(fā)率極低， 資源再生較慢，加上長期采挖，種質(zhì)資源稀缺，已瀕臨滅絕，難以滿足市場需求。廣西金線蓮是我國分布的3個主要野生居群之一，是行業(yè)公認的品質(zhì)最優(yōu)的藥材，被視為藥材珍品。目前已有的研究多以福建、廣東和臺灣金線蓮為主，且主要以莖段為外植體材料進行繁殖，未見有關(guān)利用廣西金線蓮蒴果快速繁育種苗的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法，本方法不僅可以進行工廠化生產(chǎn)以滿足市場需求，而且能有效保護野生資源。本發(fā)明一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法，包括如下步驟
(1)蒴果成熟度的選擇將野外采集的金線蓮植株引種在人工資源圃內(nèi)，于花期選擇優(yōu)良株系進行人工授粉和果實培育，金線蓮蒴果在成熟過程中，內(nèi)部種胚的顏色由乳白色漿狀逐漸轉(zhuǎn)變成金黃色的絲狀，其中以人工授粉后生長12(Γ150天的未開裂蒴果為最佳材料；
(2)種子的萌發(fā)培養(yǎng)將選取的蒴果材料經(jīng)外表滅菌處理后，取出內(nèi)部的種胚，均勻的撒播到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在溫度M 28°C、光照強度20Mfflol ·πΓ2 ^人光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)25天后，種子萌發(fā)形成原球莖；
(3)原球莖的分化將播種后形成的原球莖及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，在溫度M 28°C、 光照強度30 Mfliol · m_2 · s_\光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)2(Γ30天，原球莖分化形成帶葉的芽苗；
(4)分化苗的增殖及壯苗培養(yǎng)將原球莖分化的幼嫩芽苗轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)接到增殖及壯苗培養(yǎng)基里，在溫度M 28°C、光照強度40Mfflol ·πΓ2 .s—1、光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)約30天可培養(yǎng)出recm高的健壯大苗；
(5)生根培養(yǎng)經(jīng)已分化的廣西金線蓮芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，在溫度對 281、光照強度40Mfflol · m_2 · s—1、光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)約35天可培養(yǎng)出5cm高以上根系發(fā)達的完整大苗；
(6)馴化及移栽經(jīng)過生根培養(yǎng)的健壯大苗，待根系生長發(fā)達后，便可進行出瓶移栽。出瓶前，將試管苗轉(zhuǎn)移到溫室大棚內(nèi)煉苗15 20天，然后將試管苗從瓶中取出，小心地將根部附著的培養(yǎng)基洗凈，待植株表面水分稍干便可種植。腐殖土或塘泥均可作為移栽基質(zhì)，移栽
3后保持溫度為22l8°C，濕度為75% 80%，成活率達到95%以上。所述蒴果消毒是將外植體在流動的自來水下沖洗干凈后，置于超凈工作臺上用 70%的酒精浸泡60秒，再用0. 1%的HgCl2消毒8分鐘，取出用無菌水浸洗5次，用無菌濾紙吸干材料表面水分。步驟(2)中所述萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+AC1. Og/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. 0g/L，pH為5. 8。步驟(3)中所述原球莖分化培養(yǎng)基為MS+馬鈴薯汁200g/L +ACl. Og/L+蔗糖30g/ L+瓊脂 6. Og/L，pH 5.8。步驟(4)中所述增殖及壯苗培養(yǎng)基為MS+香蕉汁100g/L +ACl. 0g/L+蔗糖30g/L+ 瓊脂 6. 0g/L, pH 5. 8
步驟(5)中所述生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0. 5 1. 0mg/L+蔗糖20g/L +瓊脂6. 0g/L, pH
5. 8。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明以金線蓮蒴果為外植體，通過種子一原球莖一完整植株一移栽的途徑快速繁育種苗，建立了金線蓮蒴果快速繁殖再生體系，該體系中種子和原球莖使用無激素培養(yǎng)，原球莖不經(jīng)過繼代培養(yǎng)直接分化成苗，形成完整的小植株。該方法具有生長周期短、生產(chǎn)成本低、品質(zhì)好、可規(guī)?；a(chǎn)種苗的特點；另外，利用該方法繁殖的金線蓮種苗，避免了衰退、變異等問題的發(fā)生，有利于保持種苗的優(yōu)良性狀，提高種苗使用的安全性，對瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續(xù)利用具有十分積極的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是對本發(fā)明的限定。實施例一
本發(fā)明一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法，包括如下步驟
(1)蒴果成熟度的選擇將野外采集的金線蓮植株引種在人工資源圃內(nèi)，于花期選擇優(yōu)良株系進行人工授粉和果實培育，金線蓮蒴果在成熟過程中，內(nèi)部種胚的顏色由乳白色漿狀逐漸轉(zhuǎn)變成金黃色的絲狀，其中以人工授粉后生長12(Γ150天的未開裂蒴果為最佳材料；
(2)種子的萌發(fā)培養(yǎng)成熟蒴果經(jīng)滅菌處理后，取出內(nèi)部的種胚，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基 lAMS+ACl.Og/L+蔗糖30g/L + 瓊脂6. 0g/L上，在溫度M 28°C、光照強度20 Mmol ^2-s"1, 光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)25 35天，種子萌發(fā)形成白色原球莖，萌發(fā)率為80. 3% ；
(3)原球莖的分化將播種后形成原球莖及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基1/2MS+馬鈴薯汁200 g/L+ AC 1.(^/1+蔗糖3(^/1+瓊脂6.(^/1、？!1 5. 8 上，在溫度 °C、光照強度 30 Mfflol · m_2 · 光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)2(Γ25天，原球莖分化形成帶葉的芽苗，分化率為79%，苗高廣3cm。(4)增殖及壯苗培養(yǎng)將原球莖分化的幼嫩芽苗轉(zhuǎn)入MS+香蕉汁100g/L +ACl. Og/ L+蔗糖30 g/L +瓊脂6. 0g/L的增殖及壯苗培養(yǎng)基里，培養(yǎng)約30天可培養(yǎng)出Tecm高的健壯大苗。(5)生根培養(yǎng)將培養(yǎng)獲得的健壯大苗轉(zhuǎn)入1/2MS+NAA0. 2mg/L+蔗糖20 g/L +瓊脂6. 0g/L的生根培養(yǎng)基里，培養(yǎng)約35天，生根率為88. 7%，平均株高為5. 6cm，此時可出瓶煉苗、移栽。
(6)馴化及移栽出瓶前，將試管苗轉(zhuǎn)移到溫室大棚內(nèi)煉苗15 20天，然后將生長健壯的試管苗從瓶中取出，小心地將根部附著的培養(yǎng)基洗凈，待植株表面水分稍干便可種植。腐殖土或塘泥均可作為移栽基質(zhì)，移栽后保持溫度為22l8°C，濕度為75% 80%。實施例二
本發(fā)明一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法，包括如下步驟
(1)蒴果成熟度的選擇將野外采集的廣西金線蓮植株引種在人工資源圃內(nèi)，于花期選擇優(yōu)良株系進行人工授粉，采摘人工授粉后生長9(Γ120天的蒴果，于室內(nèi)用自來水洗去表面灰塵，并用刀片輕輕削去表面的臟物，然后移至超凈工作臺內(nèi)進行無菌操作，先放入75% 酒精中浸泡30秒后，轉(zhuǎn)入0. l%HgCl2溶液中消毒8min，期間不斷搖動，無菌水漂洗5遍，用無菌濾紙吸干材料表面水分，取出內(nèi)部的種胚，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在溫度M 28°C、光照強度20 μπιο ·!^2·^、光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)25 30天，種子萌發(fā)形成原球莖， 萌發(fā)率為76. 3% ；
(2)種子的萌發(fā)培養(yǎng)成熟蒴果經(jīng)滅菌處理后，取出內(nèi)部的種胚，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基 MS+AC1. Og/L+ 蔗糖 30g/L + 瓊脂 6. Og/L 上，在溫度 24l8°C、光照強度 20 Mmol · m_2 · s-1、 光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)25 35天，種子萌發(fā)形成白色原球莖，萌發(fā)率為82. 5% ；
(3)原球莖的分化將播種后形成原球莖及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS+馬鈴薯汁200g/ L + AC 1.0 g/L+蔗糖30 g/L +瓊脂6. 0 g/L、pH 5. 8上，在溫度24 28°C、光照強度30 Mfflol · m_2 · 光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)2(Γ25天，原球莖分化形成帶葉的芽苗，分化率為100%，苗高2、cm。(4)生根培養(yǎng)將培養(yǎng)獲得的健壯大苗轉(zhuǎn)入1/2MS+NAA0. 5mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6. Og/L的生根培養(yǎng)基里，培養(yǎng)約35天，生根率為100%，平均株高為6. 1cm，此時可出瓶煉苗、移栽。其余均與實施例1相同。實施例三
本發(fā)明一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法， 包括如下步驟
(1)蒴果成熟度的選擇將野外采集的廣西金線蓮植株引種在人工資源圃內(nèi)，于花期選擇優(yōu)良株系進行人工授粉，采摘人工授粉后生長12(Γ150天的蒴果，于室內(nèi)用自來水洗去表面灰塵，并用刀片輕輕削去表面的臟物，然后移至超凈工作臺內(nèi)進行無菌操作，先放入75%酒精中浸泡30秒后，轉(zhuǎn)入0. 1% HgCl2溶液中消毒8min，期間不斷搖動，無菌水漂洗5遍，用無菌濾紙吸干材料表面水分，取出內(nèi)部的種胚，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在溫度 24l8°C、光照強度20 tool ·πΓ2· s—1、光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)25 30天，種子萌發(fā)形成原球莖，萌發(fā)率為81. 9%;
(2)種子的萌發(fā)培養(yǎng)成熟蒴果經(jīng)滅菌處理后，取出內(nèi)部的種胚，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基 MS+蔗糖30g/L +瓊脂6. Og/L上，在溫度24l8°C、光照強度20 Mmol · m_2 · s—1、光照時間 12 h/d的條件下，培養(yǎng)25 35天，種子萌發(fā)形成白色原球莖，萌發(fā)率為77. 8% ；
(3)原球莖的分化將播種后形成原球莖及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS+馬鈴薯汁IOOg/ L + AC 1.0 g/L+蔗糖30 g/L +瓊脂6. 0 g/L、pH 5. 8上，在溫度24 28°C、光照強度30 Mfflol · m_2 · 光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)2(Γ25天，原球莖分化形成帶葉的芽苗，分化率為100%，苗高l、cm。
(4)生根培養(yǎng)將培養(yǎng)獲得的健壯大苗轉(zhuǎn)入1/2MS+NAA1. Omg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6. Og/L的生根培養(yǎng)基里，培養(yǎng)約35天，生根率為100%，平均株高為6. Ocm,此時可出瓶煉苗、移栽。其余均與實施例1相同。下面表1至表3顯示實例一至三中不同的蒴果成熟度及培養(yǎng)基配方對萌發(fā)、繼代和生根培養(yǎng)的影響。表1不同成熟度種子的萌發(fā)情況
權(quán)利要求
1.一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法，包括如下步驟(1)蒴果成熟度的選擇將野外采集的金線蓮植株引種在人工資源圃內(nèi)，于花期選擇優(yōu)良株系進行人工授粉和果實培育，金線蓮蒴果在成熟過程中，內(nèi)部種胚的顏色由乳白色漿狀逐漸轉(zhuǎn)變成金黃色的絲狀，其中以人工授粉后生長12(Γ150天的未開裂蒴果為最佳材料；(2)種子的萌發(fā)培養(yǎng)將選取的蒴果材料經(jīng)外表滅菌處理后，取出內(nèi)部的種胚，均勻的撒播到萌發(fā)培養(yǎng)基上，在溫度M 28°C、光照強度20Mfflol ·πΓ2 ^人光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)25天后，種子萌發(fā)形成原球莖；(3)原球莖的分化將播種后形成的原球莖及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，在溫度M 28°C、 光照強度30 Mfliol · m_2 · s_\光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)2(Γ30天，原球莖分化形成帶葉的芽苗；(4)分化苗的增殖及壯苗培養(yǎng)將原球莖分化的幼嫩芽苗轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)接到增殖及壯苗培養(yǎng)基里，在溫度M 28°C、光照強度40Mfflol ·πΓ2 .s—1、光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)約30天可培養(yǎng)出recm高的健壯大苗；(5)生根培養(yǎng)經(jīng)已分化的廣西金線蓮芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，在溫度對 281、光照強度40Mfflol · m_2 · s—1、光照時間12 h/d的條件下，培養(yǎng)約35天可培養(yǎng)出5cm高以上根系發(fā)達的完整大苗；(6)馴化及移栽經(jīng)過生根培養(yǎng)的健壯大苗，待根系生長發(fā)達后，便可進行出瓶移栽； 出瓶前，將試管苗轉(zhuǎn)移到溫室大棚內(nèi)煉苗15 20天，然后將試管苗從瓶中取出，小心地將根部附著的培養(yǎng)基洗凈，待植株表面水分稍干便可種植，腐殖土或塘泥均可作為移栽基質(zhì)，移栽后保持溫度為22l8°C，濕度為75% 80%，成活率達到95%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(2)中所述萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+AC1.Og/ L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. Og/L, pH 為 5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(3)中所述原球莖分化培養(yǎng)基為MS+馬鈴薯汁 200g/L +ACl. Og/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. Og/L, pH 5. 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(4)中所述增殖及壯苗培養(yǎng)基為MS+香蕉汁 100g/L +ACl. 0g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. 0g/L, pH 5. 8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(5)中所述生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA0. 5 1. 0mg/L+ 蔗糖 20g/L + 瓊脂 6. 0g/L, pH 5. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述消毒是將外植體用在流動的自來水下沖洗干凈后，置于超凈工作臺上用70%的酒精浸泡60s，再用0. 1%的HgCl2消毒8分鐘，取出用無菌水浸洗5次，用無菌濾紙吸干材料表面水分后將蒴果縱向剖開，將里面細小的種子取出，均勻的灑在培養(yǎng)基的表面。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用廣西金線蓮蒴果快速繁育其種苗的方法，它是以分布于廣西桂林地區(qū)的野生金線蓮進行人工授粉所得的蒴果為外植體，通過種子→原球莖→完整植株→移栽的途徑快速繁育種苗。繁育過程中，種子和原球莖使用無激素培養(yǎng)，原球莖不經(jīng)過繼代培養(yǎng)直接分化成苗形成完整的小植株。一顆廣西金線蓮蒴果通過8~10月的組培培養(yǎng)，可快繁培育出10萬株以上的優(yōu)質(zhì)組培苗，煉苗移栽成活率達到95％以上。該項技術(shù)操作簡便，生產(chǎn)成本低，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應用。利用該項技術(shù)繁殖金線蓮，有利于保持種苗的優(yōu)良性狀，提高種苗使用的安全性，對瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續(xù)利用具有十分積極的影響。
文檔編號A01H4/00GK102499088SQ20111034331
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者付傳明, 何金祥, 唐鳳鸞, 石云平, 趙志國, 黃寧珍 申請人:廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所