專利名稱：一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法
技術領域：
本發明涉及一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法，具體地說是一種采用水胺硫磷對SD大鼠進行長期灌胃，通過水胺硫磷對SD大鼠血管及大腦神經組織造成慢性損傷以建立血管性癡呆大鼠模型。
背景技術：
VD (Vascular Dementia，VD)是由于一系列血管損傷因素導致腦組織損害而引起的癡呆綜合癥。以記憶力受損、認知功能下降為主，或伴有語言功能下降以及情感、人格障礙為主要臨床表現的一組神智異常癥候群。
在歐美國家中，VD占老年癡呆總數的15% ；在中國、日本等亞洲國家，VD占老年癡呆總數的50%。目前，我國的VD患病率為324/10萬，彡65歲人群中VD的患病率為1. 3%。 并且，隨著人口老齡化和血管性疾病的發病率增高，VD的發病率呈上升趨勢。現代醫學研究認為，VD為多因素損傷性疾病，其病因可能包括高血壓、糖尿病、動脈硬化、冠心病、腦梗塞、腦缺血再灌注損傷等，其誘因可能包括吸煙、飲酒、環境污染、電離輻射等。遺憾的是，迄今為止尚未確定VD發病的真正原因，更未找到理想的抗VD藥物。因此，無論從VD的病因或是誘因入手，找到正確的治療靶點，開發理想的干預藥物，將對保障人類健康及提高老年人生活質量做出貢獻！動物模型的建立是研究疾病發病機理的必要條件。目前，常見的VD模型建立方法包括①血管外阻斷法，如四血管阻斷法(four vessel occlusion，4V0)、三血管阻斷法 (three vessel occlusion, 3V0)、兩血管阻斷法(two vessel occlusion, 2V0)；②血管內栓法；③大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCA0)；④高血壓腦卒中自發大鼠動物模型(stroke—prone spontaneously hypertensive rats, SPSHR)；(5)去大腦皮層VD動物模型；⑥立體定向光化學誘導腦梗死模型；⑦腦內注射內皮素法。
雖然VD動物模型的建立方法較多，但每種方法都是從模擬人類VD發病的某一個側面來完成的，與臨床實際情況尚有一定偏離，主要問題有以下幾點①目前VD模型都是建立在有創傷的基礎之上，大鼠本身耐受性差，創傷性模型導致大鼠死亡率高；②VD病因復雜，影響因素較多，發病時程較長。而目前的VD模型建立的時間一般較短，不能完全反應實際情況；③創傷本身對機體造成的應激對VD模型的穩定性有一定的影響。因此，建立一種長期、慢性的無創性VD模型對于研究VD的發病機理很有必要！一些社會調查數據顯示，長期、低劑量接觸有機磷農藥能夠導致記憶力受損、認知及語言功能下降、情感障礙等癥狀。①ffesseling C對157名長期暴露于有機磷環境中的香蕉工人進行精神心理數字編碼分析，結果顯示，長期、低劑量接觸有機磷農藥造成明顯的語言功能下降及人格障礙(Wesseling C, Keifer M, Ahlbom A, McConnell R, Moon JD, Rosenstock L, Hogstedt C. Long-term neurobehavioral effects of mild poisonings with organophosphate and n—methyl carbamate pesticides among banana workers. Int J Occup Environ Health, 2002. ) ；(2) Stephens R 對 146 名長期暴露于有機磷農藥環境中的羊毛工人進行神經心理學調查，結果顯示，長期、低劑量接觸有機磷農藥造成明顯的短期記憶力受損及語言功能下降，并出現認知、情感障礙等癥狀(St印hens R, Spurgeon A, Calvert IAj Beach J，Levy LSj Berry H，Harrington JM. Neuropsychological effects of long-term exposure to organophosphates in sheep dip. Lancet, 1995. )0 通過上述調查我們猜測，“長期、低劑量接觸有機磷”與“VD”存在一定的因果關系。于是，我們實驗室于2010年7月-2011年4月開展了長期、低劑量接觸水胺硫磷誘發SD大鼠產生 VD的動物實驗。通過水胺硫磷對SD大鼠的急性、慢性毒理實驗，確定水胺硫磷的灌胃濃度為0. 5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為M周。對照組采用2V0 法制備VD大鼠模型。采用大鼠跳臺試驗、避暗試驗及Morris水迷宮試驗(Morris Water Maze，MWM)來判斷大鼠記憶功能，并通過血管功能學實驗、血管及大腦神經元形態學實驗來判斷VD大鼠模型是否成功。發明內容
本發明提供了一種建立VD大鼠模型的新型方法。
本發明提供了一種無創性建立VD大鼠模型的新型方法。
本發明提供了一種利用水胺硫磷灌胃的方法建立VD大鼠模型。
本發明提供的SD大鼠為清潔級、健康SD大鼠，鼠齡為6周齡，性別為雄性，體質量為 180 220g。
本發明提供的水胺硫磷灌胃濃度為0. 5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為M周。
本發明應用的水胺硫磷可以直接購買，按照實際濃度進行稀釋。
本發明SD大鼠生長環境要求為動物房溫度為18 22°C，相對濕度為40 70%， 氣流速度為0. 1 0. 2米/秒，換氣次數為30次/小時，環境潔凈度為10000 100000級， 三級定向控制空氣壓差為0 20%，自動定時器控制光照周期(08 00 20 00為光照期， 20 00 08 00為黑暗期)，常規大鼠飼料及凈化自來水飼養。
本發明采用的灌胃方法是常用的大鼠灌胃法，灌胃針經大鼠口角插入口腔，輕壓大鼠舌根部，大鼠自主吞咽，操作人員順勢將灌胃針送入大鼠胃中，將藥物推入。
經跳臺試驗、避暗試驗、Morris水迷宮試驗、血管功能學實驗及形態學實驗證明， 該方法建立的VD大鼠模型與傳統的有創性方法制備的VD大鼠模型沒有明顯差異，說明模型成功。


圖1水胺硫磷誘發VD模型大鼠跳臺、避暗試驗潛伏期結果(—± s)(與陽性對照組比較，*P<0. 05 ；與正常對照組比較，#<0. 05)。試驗結果顯示，VD模型組大鼠跳臺試驗潛伏期與正常對照組比較明顯縮短，與陽性對照組比較，無顯著性差異； VD模型組大鼠避暗試驗潛伏期與正常對照組比較明顯縮短，與陽性對照組比較，無顯著性差異。表明造模比較理想。
圖2水胺硫磷誘發VD模型大鼠跳臺、避暗試驗錯誤次數結果(_ t s)(與陽性對照組比較，*P<0. 05 ；與正常對照組比較，#<0. 05)。試驗結果顯示，VD模型組大鼠跳臺試驗錯誤次數與正常對照組比較明顯增多，與陽性對照組比較，無顯著性差異；VD模型組大鼠避暗試驗錯誤次數與正常對照組比較明顯增多，與陽性對照組比較，無顯著性差異。表明造模比較理想。
圖3水胺硫磷誘發VD模型大鼠頸總動脈內皮依賴性舒張反應(endothe 1 ium dependence relaxation reaction，EDRR)女臺
圖4水胺硫磷誘發VD模型大鼠頸總動脈EDRR檢測Γ 士S)。與陽性對照組比較，*Ρ<0. 05 ；與正常對照組比較，#<0. 05。與正常對照組比較，VD模型組EDRR反應明顯降低， 血管內皮功能顯著下降；與陽性對照組比較，VD模型組EDRR反應無明顯差異。表明造模比較理想。
圖5水胺硫磷誘發VD模型大鼠頸總動脈血管內膜光鏡及電鏡觀察結果(光鏡照片采自新鄉醫學院組織胚胎學教研室；電鏡照片采自新鄉醫學院電鏡室)。光鏡下，VD模型組頸總動脈血管內膜出現明顯斷裂痕跡，內膜皺褶增多，脂質于內皮下沉積，有動脈硬化傾向；血管內膜下平滑肌層細胞排列紊亂，肌層出現明顯斷裂、融合現象，延續性較差，肌細胞間纖維組織增生；肌層下纖維結締組織疏松，肌層與結締組織界限不清楚。電鏡下，VD模型組內皮細胞膜出現破裂現象，平滑肌細胞延伸入內皮細胞胞漿；內皮基膜斷裂，斷裂處有大量膠原纖維組織增生；內皮細胞內高爾基體增多，線粒體腫脹、線粒體嵴融合或缺失。
圖6水胺硫磷誘發VD模型大鼠海馬CAl區皮層光鏡及電鏡觀察結果(光鏡照片采自新鄉醫學院組織胚胎學教研室；電鏡照片采自新鄉醫學院電鏡室)。光鏡下，VD模型組海馬CAl區三層錐體細胞排列紊亂；部分錐體細胞腫脹，并有炎細胞浸潤，星形膠質細胞增生；部分錐體細胞胞體變小或呈三角形，頂樹突延長，有核固縮和破裂現象，胞漿呈均勻嗜伊紅色；部分錐體細胞胞核變淺，基質疏松伴明顯的微空泡形成；血管周圍有紅細胞滲出， 尚可見小血管增生。電鏡下，VD模型血腦屏障內膜不光滑；神經元細胞皺縮、膜結構不清； 胞核固縮，染色質聚集成團、邊集，異染色質增多，核周可見高電子密度團塊；高爾基體增多，線粒體腫脹，線粒體嵴融合并出現空泡變性。
具體實施方式
實施方式用于說明本發明，但不限制本發明的范圍。大鼠體質量為200g，水胺硫磷濃度為20%。按照灌胃濃度為0. 5mg/kg計算，該大鼠需水胺硫磷0. Img0移液管吸取20%的水胺硫磷0. 5ml移至量筒中，即為含0. Img水胺硫磷的溶液。灌胃容量要求為0. 6ml(3ml/ kgX0. ^cg)。因此，在量筒中添加蒸餾水至0. 6ml，灌胃針全部吸取后，對SD大鼠進行灌胃。
實驗例檢測水胺硫磷灌胃法建立VD模型的可行性。
1、藥物水胺硫磷(LS93564，20%，湖北沙隆達股份有限公司)。
2、目的利用水胺硫磷對SD大鼠進行灌胃M周建立VD模型。
3、儀器大鼠跳臺記錄系統、大鼠避暗儀、Morris水迷宮(淮北正華生物儀器設備有限公司);MD3000生物信號采集系統(淮北正華生物儀器設備有限公司);TS1000尼康顯微鏡(日本尼康公司)；HT7700日立透射電子顯(日本日立公司)。
4、動物6周齡、雄性、18(T220g、清潔級、健康SD大鼠(河南省實驗動物中心)。
5、實驗分組①正常對照組6周齡、雄性、18(T220g、清潔級、健康SD大鼠10只，5常規飼養M周；②VD模型組6周齡、雄性、18(T220g、清潔級、健康SD大鼠10只，對其進行水胺硫磷灌胃，灌胃濃度為0. 5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為對周；③陽性對照組6周齡、雄性、18(T220g、清潔級、健康SD大鼠10只，采用2V0制備大鼠VD模型。術前1 禁食，4h禁水。用10%水合氯醛(0. 33ml/100g)腹腔注射麻醉， 保證手術期間有自主呼吸。仰臥固定，頸部去毛、強力碘消毒后沿頸正中切開，分離出雙側頸總動脈，并套以雙重“0”號線，在雙側頸總動脈的近心端及遠心端分別結扎，并從中間離斷，以確保阻斷動脈血流。注意術中無菌操作，手術切口給予慶大霉素注射液2 ml，縫合切口。術后將動物送至通風良好的動物房飼養；④陰性對照組16周齡、雄性、18(T220g、清潔級、健康SD大鼠10只，術前12h禁食，4h禁水。用10%水合氯醛(0.3:3ml/ IOOg)腹腔注射麻醉，保證手術期間有自主呼吸。大鼠麻醉后只分離雙側頸總動脈，但不結扎、不離斷動脈。
6、實驗內容大鼠跳臺試驗、大鼠避暗試驗、大鼠Morris水迷宮試驗、EDRR檢測、 大鼠頸總動脈內膜光鏡及電鏡觀察、大鼠大腦海馬CAl區皮層光鏡及電鏡觀察。
7、統計學方法所有數據以均數士標準差(―士s)表示。組間差異比較用ANOVA 及Newman-Student多重比較；t檢驗分析，由SPSS13. 0統計軟件完成，雙側P < 0. 05認為差異有顯著性。
8、結果8.1水胺硫磷誘發VD模型大鼠跳臺試驗結果見表1。VD模型組大鼠跳臺試驗潛伏期與正常對照組比較明顯縮短，與陽性對照組比較，無顯著性差異；VD模型組大鼠平均5分鐘錯誤次數與正常對照組比較明顯增多，與陽性對照組比較，無顯著性差異。表明造模比較理想。
表1水胺硫磷誘發VD模型大鼠跳臺試驗結果G 士 s)
權利要求
1.一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法。
2.根據權利要求1所述的大鼠，其特征在于清潔級、健康SD大鼠，鼠齡為6周齡，性別為雄性，體質量為18(T220g。
3.根據權利要求1所述的新型方法，其特征在于采用水胺硫磷對SD大鼠進行長期灌田冃°
4.根據權利要求3所述的灌胃，其特征在于灌胃容量為;3ml/kg，灌胃濃度為0.5mg/kg, 灌胃頻率為隔日1次。
5.根據權利要求3所述的長期，其特征在于灌胃周期為M周。
全文摘要
本發明公開了一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法。該方法采用水胺硫磷對6周齡、雄性、180~220g、清潔級、健康Sprague-Dawley(SD)大鼠進行長期灌胃。水胺硫磷的灌胃濃度為0.5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為24周。通過水胺硫磷對SD大鼠腦血管及大腦神經組織造成慢性損傷以建立血管性癡呆大鼠模型。
文檔編號A01K67/027GK102512259SQ20111036630
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者侯軟玲, 尹雅玲, 張潔, 張群妹, 朱利紅, 李鵬, 楊帆, 畢凌云, 潘國聘, 王亞莉, 王倩倩, 王建剛, 王永霞, 袁向山, 陳杰, 馬麗娟 申請人:新鄉醫學院