專利名稱：一種小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法
一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于單倍體育種技術(shù)領(lǐng)域，具體的講涉及一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法。
背景技術(shù)：
單倍體育種途徑包括花藥/花粉粒培養(yǎng)、子房/胚珠培養(yǎng)、遠(yuǎn)緣雜交單倍體誘導(dǎo)， 小麥χ玉米遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)單倍體技術(shù)由knkteler和Nitzsche于1984報導(dǎo)，該技術(shù)與其它單倍體培養(yǎng)方法相比，具有較少的基因依賴型和較高的植株產(chǎn)生頻率，不產(chǎn)生白化苗，逐漸被育種家接受和應(yīng)用(Mahmoodi，2004)，是目前使用較廣泛的單倍體生產(chǎn)方式。然而，目前國內(nèi)外報道關(guān)于小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)、單倍體胚誘導(dǎo)和單倍體苗產(chǎn)生頻率還不穩(wěn)定，加倍單倍體植株成功率相對較低，單倍體育種手段不甚成熟(Niroula and Bimb, 2009)。
在小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)胚形成的過程中，由于環(huán)境不可控因素較多，而且麥穗不同穗位的小花成熟度及營養(yǎng)狀況的差異，造成誘導(dǎo)的單倍體胚中總有相當(dāng)數(shù)量的小胚，在剝胚進(jìn)行離體培養(yǎng)時，同一胚齡的胚小的不足300 μ m大的1000 μ m以上，過去沒有針對小胚的培養(yǎng)基，大、小胚接種到同種培養(yǎng)基中，體積在400 μ m以下的單倍體幼胚不能萌發(fā)成苗。
小麥單倍體苗在培養(yǎng)基中生成3個葉或形成3個以上分蘗時，沖洗掉根部的培養(yǎng)基，移栽煉苗；低溫春化、分蘗返青后刨出，洗去附著在根上的泥土，剪根保留3cm的根長； 秋水仙素溶液浸泡麥苗使分蘗節(jié)處于液面下3cm，進(jìn)行染色體加倍；處理后的麥苗經(jīng)清水沖洗后再次栽種，緩苗半月后正常管理。經(jīng)過了單倍體組培苗洗根移栽一春化返青后刨出洗根剪根一染色體加倍一沖洗再移栽的過程。不但工序繁雜，而且，麥苗春化返青后苗較大，用秋水仙素加倍處理時需要剪根，根部受到損傷，成活率低。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題就是提供一種可提高單倍體胚成苗率和染色體加倍成活率和成功率、簡化小麥育種程序、提高育種效率、縮短育種周期、對加快培育優(yōu)良品種具有明顯成效的小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為 該方法包括下列步驟第一步，種植將小麥、玉米分期種植，花期相遇； 第二步，單倍體誘導(dǎo)用新鮮玉米花粉為小麥柱頭授粉，形成受精卵，通過激素誘導(dǎo)，形成小麥單倍體幼胚； 第三步，單倍體胚的剝離小麥單倍體幼胚經(jīng)14-20天發(fā)育后，在解剖鏡下進(jìn)行剝胚，并根據(jù)胚的大小將胚分成后大胚和小胚兩部分直徑大于400 μ m的胚為大胚，直徑小于等于400 μ m的胚為小胚； 第四步，將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗a、小胚離體培養(yǎng)，將小胚置于小胚培養(yǎng)基中室溫暗培養(yǎng)9-11天，有新芽萌動后，轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗， 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. 09-0. llmg/L、 甘氨酸 1. 9-2. lmg/L乳氨酸 550-650mg/L糖 45-55g/L、瓊脂 6. 5-7. 5g/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS 培養(yǎng)基，糖 2446g/L 瓊脂 6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ；b、大胚離體培養(yǎng)將大胚在大胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-20天，有新芽萌動后，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗，所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 19-0. 21 mg/L吲哚乙酸 0. 19-0. 21 mg/L糖 2446g/L瓊脂6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ； 第五步，春化和加倍待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20-25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由500 -750 mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下2. 5cm-3. 5 cm,在23_25°C加光照條件下處理6-8小時進(jìn)行染色體加倍； 第六步，移栽將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理； 第七步，收獲小麥成熟后，收獲獲得雙單倍體種子。
其附加技術(shù)特征為 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L、 甘氨酸2. Omg/L乳氨酸600mg/L糖 50g/L、瓊脂 7. Og/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基，糖25g/L 瓊脂7. Og/L,且其PH值=5. 8 ； 所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 20 mg/L吲哚乙酸 0. 20 mg/L糖25g/L瓊脂7. Og/L,且其pH值=5. 8。
在所述第五步春化和加倍步驟中待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20-25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由625mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20 組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下3. 0 cm，在加光照條件下處理7小時進(jìn)行染色體加倍；在所述第六步移栽步驟中將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理；本發(fā)明提供的一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法，同現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下優(yōu)點由于該方法包括下列步驟 第一步，種植將小麥、玉米分期種植，花期相遇； 第二步，單倍體誘導(dǎo)用新鮮玉米花粉為小麥柱頭授粉，形成受精卵，通過激素誘導(dǎo)，形成小麥單倍體幼胚； 第三步，單倍體胚的剝離小麥單倍體幼胚經(jīng)14-20天發(fā)育后，在顯微鏡下進(jìn)行剝胚，并根據(jù)胚的大小將胚分成后大胚和小胚兩部分直徑大于400 μ m的胚為大胚，直徑小于等于400 M m的胚為小胚； 第四步，將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗a、小胚離體培養(yǎng)，將小胚置于小胚培養(yǎng)基中室溫暗培養(yǎng)9-11天，有新芽萌動后，轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗， 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. 09-0. llmg/L、 甘氨酸 1. 9-2. lmg/L乳氨酸 550-650mg/L糖 45-55g/L、瓊脂 6. 5-7. 5g/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS 培養(yǎng)基，糖 2446g/L 瓊脂 6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ；b、大胚離體培養(yǎng)將大胚在大胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-20天，有新芽萌動后，在室溫和14h光照條件下培養(yǎng)，分化出芽、根及分蘗，所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 19-0. 21 mg/L吲哚乙酸 0. 19-0. 21 mg/L糖 2446g/L瓊脂6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ； 第五步，春化和加倍待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20-25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由500 -750 mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下2. 5cm-3. 5 cm,在23_25°C加光照條件下處理6-8小時進(jìn)行染色體加倍； 第六步，移栽將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理； 第七步，收獲小麥成熟后，收獲獲得雙單倍體種子。
大胚在大胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)；小胚先經(jīng)過小胚培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)；在小胚培養(yǎng)基中，蔗糖作為碳源提供給胚營養(yǎng)，高濃度的蔗糖可保持培養(yǎng)基高滲透壓；水解乳蛋白(LH)為氨基酸的混合物，對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用；較高維生素含量，以輔酶的形式參與生物催化劑一酶系的活動，參與細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂肪、糖代謝等重要生命活動；微量的2，4-D生長調(diào)節(jié)劑，是小麥胚誘導(dǎo)和生長必需的激素，誘導(dǎo)愈傷和胚狀體的分化，根據(jù)以上營養(yǎng)物質(zhì)配制小胚培養(yǎng)基具有較高的糖濃度、較高滲透壓、較豐富氨基酸種類、較高維生素的含量以及包含微量的生長調(diào)節(jié)因子，適合小胚生長；這樣， 小胚萌發(fā)成苗率75%以上；并且離體培養(yǎng)的組培苗經(jīng)低溫春化后，直接進(jìn)行染色體加倍并栽種，簡化了單倍體苗洗苗移栽一春化后刨出洗根剪根一染色體加倍一再移栽的步驟，在麥苗春化后苗較小，秋水仙素加倍時根部沒有受傷，處理簡單，加倍后多個分蘗可結(jié)實，加倍處理效率89%以上， 較原方法提高19%。
小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交高效生產(chǎn)小麥雙單倍體的新方法，提高了單倍體胚成苗率和染色體加倍處理效率，簡化了小麥育種程序，提高了育種效率，縮短了育種周期，對加快培育優(yōu)良品種具有明顯成效。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所提出的一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法的結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步說明。
本發(fā)明一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法， 該方法包括下列步驟第一步，種植將小麥、玉米分期種植，花期相遇； 第二步，單倍體誘導(dǎo)用新鮮玉米花粉為小麥柱頭授粉，形成受精卵，通過激素誘導(dǎo)，形成小麥單倍體幼胚；第三步，單倍體胚的剝離小麥單倍體幼胚經(jīng)14-20天發(fā)育后，在顯微鏡下進(jìn)行剝胚，并根據(jù)胚的大小將胚分成后大胚和小胚兩部分直徑大于400 μ m的胚為大胚，直徑小于等于400 μ m的胚為小胚； 第四步，將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗a、小胚離體培養(yǎng)，將小胚置于小胚培養(yǎng)基中室溫暗培養(yǎng)9-11天，有新芽萌動后，轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗， 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. 09-0. llmg/L、 甘氨酸 1. 9-2. lmg/L乳氨酸 550-650mg/L糖 45-55g/L、瓊脂 6. 5-7. 5g/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS 培養(yǎng)基，糖 2446g/L 瓊脂 6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ；b、大胚離體培養(yǎng)將大胚在大胚培養(yǎng)基中7-20天，有新芽萌動后，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、 根及分蘗所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 19-0. 21 mg/L吲哚乙酸 0. 19-0. 21 mg/L糖 2446g/L瓊脂6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ； 第五步，春化和加倍待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20-25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由500 -750 mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下2. 5cm-3. 5 cm,在23_25°C加光照條件下處理6-8小時進(jìn)行染色體加倍； 第六步，移栽將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理； 第七步，收獲小麥成熟后，收獲獲得雙單倍體種子。
所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. lmg/L、 甘氨酸2. Omg/L乳氨酸600mg/L糖 50g/L、瓊脂 7. Og/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基，糖且其PH值=5. 8 ； 所述大胚培養(yǎng)基配方為 1/2MS培養(yǎng)基吲哚乙酸 0. 20 mg/L 瓊脂7. Og/L,25g/L 瓊脂 7. Og/L,芐基氨基嘌呤 0. 20 mg/L 糖 25g/L且其PH值=5. 8 ；在所述第五步春化和加倍步驟中待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20-25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由625mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20 組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于加倍溶液液面下3. 0 cm，在加光照條件下處理 7小時進(jìn)行染色體加倍；在所述第六步移栽步驟中將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理。
實施例1該方法包括下列步驟 第一步，種植將小麥、玉米分期種植，花期相遇； 第二步，單倍體誘導(dǎo)用新鮮玉米花粉為小麥柱頭授粉，形成受精卵，通過激素誘導(dǎo)，形成小麥單倍體幼胚； 第三步，單倍體胚的剝離小麥單倍體幼胚經(jīng)14天發(fā)育后，在顯微鏡下進(jìn)行剝胚，并根據(jù)胚的大小將胚分成后大胚和小胚兩部分直徑大于400 μ m的胚為大胚，直徑小于等于400 μ m的胚為小胚； 第四步，將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗a、小胚離體培養(yǎng)，將小胚置于小胚培養(yǎng)基中室溫暗培養(yǎng)11天，有新芽萌動后，轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗， 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. 09mg/L、 甘氨酸1.9mg/L乳氨酸550mg/L糖 45g/L、瓊脂 6. 5g/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基，糖Mg/L 瓊脂6. 5g/L，且其PH值=5. 8 ；b、大胚離體培養(yǎng)將大胚在大胚培養(yǎng)基中7-20天，有新芽萌動后，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 19mg/L吲哚乙酸 0. 19mg/L糖Mg/L瓊脂6. 5g/L，且其PH值=5. 8 ； 第五步，春化和加倍待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由500 mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下2. 5cm,在25°C加光照條件下處理8小時進(jìn)行染色體加倍； 第六步，移栽將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理； 第七步，收獲小麥成熟后，收獲獲得雙單倍體種子。
實施例2該方法包括下列步驟 第一步，種植將小麥、玉米分期種植，花期相遇； 第二步，單倍體誘導(dǎo)用新鮮玉米花粉為小麥柱頭授粉，形成受精卵，通過激素誘導(dǎo)，形成小麥單倍體幼胚； 第三步，單倍體胚的剝離小麥單倍體幼胚經(jīng)20天發(fā)育后，在顯微鏡下進(jìn)行剝胚，并根據(jù)胚的大小將胚分成后大胚和小胚兩部分直徑大于400 μ m的胚為大胚，直徑小于等于400 μ m的胚為小胚； 第四步，將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗a、小胚離體培養(yǎng)，將小胚置于小胚培養(yǎng)基中室溫暗培養(yǎng)9天，有新芽萌動后，轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗， 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. llmg/L、 甘氨酸2. lmg/L乳氨酸650mg/L糖 ^g/L、瓊脂 7. 5g/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基，糖^g/L 瓊脂7.5g/L，且其PH值=5. 8 ；b、大胚離體培養(yǎng)將大胚在大胚培養(yǎng)基中7-20天，有新芽萌動后，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、 根及分蘗，所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 21mg/L吲哚乙酸0. 21 mg/L糖^g/L瓊脂7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ； 第五步，春化和加倍待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由750 mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下3. 5 cm,在23°C加光照條件下處理6小時進(jìn)行染色體加倍； 第六步，移栽將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理； 第七步，收獲小麥成熟后，收獲獲得雙單倍體種子。
實施例3該方法包括下列步驟 第一步，種植將小麥、玉米分期種植，花期相遇； 第二步，單倍體誘導(dǎo)用新鮮玉米花粉為小麥柱頭授粉，形成受精卵，通過激素誘導(dǎo)，形成小麥單倍體幼胚； 第三步，單倍體胚的剝離小麥單倍體幼胚經(jīng)17天發(fā)育后，在顯微鏡下進(jìn)行剝胚，并根據(jù)胚的大小將胚分成后大胚和小胚兩部分直徑大于400 μ m的胚為大胚，直徑小于等于400 μ m的胚為小胚； 第四步，將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗a、小胚離體培養(yǎng)，將小胚置于小胚培養(yǎng)基中室溫暗培養(yǎng)10天，有新芽萌動后，轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗， 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4-二氯苯氧乙酸0. 10mg/L、 甘氨酸2. Omg/L乳氨酸600mg/L糖 50g/L、瓊脂 7. Og/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基，糖25g/L 瓊脂7. Og/L,且其PH值=5. 8 ；b、大胚離體培養(yǎng)將大胚在大胚培養(yǎng)基中7-20天，有新芽萌動后，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、 根及分蘗所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 20 mg/L吲哚乙酸 0. 20 mg/L糖25g/L瓊脂7. Og/L,且其PH值=5. 8 ； 第五步，春化和加倍待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化22天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由625 mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下3. Ocm,在加光照條件下處理7小時進(jìn)行染色體加倍； 第六步，移栽將處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理； 第七步，收獲小麥成熟后，收獲獲得雙單倍體種子。
小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交高效生產(chǎn)小麥雙單倍體的新方法，提高了單倍體胚成苗率和染色體加倍處理效率，簡化了小麥育種程序，提高了育種效率，縮短了育種周期，對加快培育優(yōu)良品種具有明顯成效。
權(quán)利要求
1. 一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法，其特征在于該方法包括下列步驟第一步，種植將小麥、玉米分期種植，花期相遇； 第二步，單倍體誘導(dǎo)用新鮮玉米花粉為小麥柱頭授粉，形成受精卵，通過激素誘導(dǎo)，形成小麥單倍體幼胚； 第三步，單倍體胚的剝離小麥單倍體幼胚經(jīng)14-20天發(fā)育后，在解剖鏡下進(jìn)行剝胚，并根據(jù)胚的大小將胚分成大胚和小胚兩部分直徑大于400μm的胚為大胚，直徑小于等于400 μ m的胚為小胚； 第四步，將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗a、小胚離體培養(yǎng)將小胚置于小胚培養(yǎng)基中室溫暗培養(yǎng)9-11天，有新芽萌動后，轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗， 所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 2，4- 二氯苯氧乙酸0. 09-0. llmg/L、 甘氨酸 1. 9-2. lmg/L乳氨酸 550-650mg/L糖 45-55g/L、瓊脂 6. 5-7. 5g/ L，且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為1/2MS 培養(yǎng)基，糖 2446g/L 瓊脂 6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ；b、大胚離體培養(yǎng)將大胚接種在大胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-20天，有新芽萌動后，在室溫和14h光照條件下，分化出芽、根及分蘗，所述大胚培養(yǎng)基配方為1/2MS培養(yǎng)基6-芐基氨基嘌呤 0. 19-0. 21 mg/L吲哚乙酸 0. 19-0. 21 mg/L糖 2446g/L瓊脂6. 5-7. 5g/L，且其PH值=5. 8 ； 第五步，春化和加倍待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20-25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由500 -750 mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于溶液液面下2. 5cm-3. 5 cm,在23_25°C加光照條件下處理6-8小時進(jìn)行染色體加倍； 第六步，移栽處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理；第七步，收獲小麥成熟后，收獲獲得雙單倍體種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法，其特征在于所述小胚培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基與B5維生素、 甘氨酸2. Omg/L 糖 50g/L、 且其PH值=5. 8 ； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為2，4-二氯苯氧乙酸0. lmg/L、 乳氨酸600mg/L 瓊脂 7. Og/ L，1/2MS培養(yǎng)基， 且其PH值=5. 8 ； 所述大胚培養(yǎng)基配方為 1/2MS培養(yǎng)基吲哚乙酸 0. 20 mg/L糖 25g/L瓊脂 7. Og/L,6-芐基氨基嘌呤 0. 20 mg/L 糖 25g/L瓊脂7. Og/L,且其pH值=5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥X玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法，其特征在于在所述第五步春化和加倍步驟中待單倍體苗長到3葉或3個分蘗時，低溫春化20-25天，室溫緩苗2天，然后沖洗掉根部的培養(yǎng)基，將麥苗浸入由625mg/L的秋水仙素+20g/L的二甲基亞砜+0. 5g/L的吐溫-20 組成的染色體加倍溶液，使分蘗節(jié)處于液面下3. 0 cm，在加光照條件下處理7小時進(jìn)行染色體加倍；在所述第六步移栽步驟中處理后的麥苗清水沖洗浸泡1天，移栽到溫室或田間草炭土中，遮陰保濕緩苗半月后正常管理。
全文摘要
本發(fā)明屬于單倍體育種技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交生產(chǎn)小麥雙單倍體的方法。其主要技術(shù)特征為種植、單倍體胚誘導(dǎo)、單倍體胚剝離、將小胚和大胚分別離體培養(yǎng)成單倍體苗、春化、染色體加倍、移栽和收獲等步驟，大胚在大胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)，小胚先經(jīng)過小胚培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后再進(jìn)入基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，小胚培養(yǎng)基具有較高的糖濃度、較高滲透壓、較豐富氨基酸種類、較高維生素含量以及包含微量的生長調(diào)節(jié)因子，小胚萌發(fā)成苗率75%以上；離體培養(yǎng)的組培苗經(jīng)低溫春化后，直接進(jìn)行染色體加倍并栽種，加倍處理效率89%以上，提高了單倍體胚成苗率、染色體加倍成活率和成功率，簡化了小麥育種程序，提高了育種效率，縮短了育種周期，對加快培育優(yōu)良品種具有明顯成效。
文檔編號A01H4/00GK102487816SQ20111036703
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者宋聰敏, 崔銀輝, 龐建周, 王雪征, 茜曉哲, 趙鳳梧, 陳淑萍, 馬洪彬 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所