專利名稱：一種簕杜鵑的化學誘變育種方法
技術領域：
本發明涉及園藝木、藤本植物育種領域，特別是簕杜鵑的化學誘變育種領域。
技術背景
簕杜鵑(Bougainvillea spp.)為紫茉莉科(Nyetaginaceae)寶巾屬植物，又名寶巾、三角梅、九重葛、葉子花等，原產于熱帶美洲，19世紀傳入歐洲，后經美國和日本傳入東南亞各國。20世紀50年代開始在我國南方大量引進種植，簕杜鵑以其苞片色彩的變化多端而富于觀賞性，在中國南方的諸多大城市已經成為綠化的主要品種之一，是重要的園林觀賞植物。
誘變育種技術在觀賞植物品種改良上有獨特的作用，是對育種手段不足的一種有益補充，它可以誘發基因突變，產生自然界原來沒有的或一般常規方法無法獲得的新類型、 新性狀、新基因，能夠打破基因連鎖，提高重組率，在DNA水平上，誘變育種往往會導致比同源和異源轉基因更大的轉變。
誘變育種技術主要可分為輻照誘變和化學誘變兩種形式。輻照誘變主要是選擇利用各種射線(如Co6tl-Y射線)在一定劑量水平上對生物活體材料進行照射，造成生物細胞內染色體水平的畸變，如倒位、缺失等形成突變。其特點是對染色體傷害較大，因此致死突變較多，這是早期誘變技術的主流形式?；瘜W誘變則通過一定濃度范圍的化學誘變劑(如甲基磺酸乙酯、疊氮化鈉等)對活體材料進行涂抹、注射、浸泡等處理方式造成生物細胞內 DNA的損傷和錯誤修復等，產生突變體。具備易操作，劑量率易控制，對基因組損傷小，突變率高等特點，是現今廣為流行的一種育種方式。
國內絕大部分簕杜鵑品種都不能收獲種子，因而都是利用插條進行扦插繁殖(無性繁殖)，不能像有性世代那樣進行雜交而創造出新品種，這給簕杜鵑的育種工作帶來一定難度。物理誘變的方法存在處理成本高、長途運輸影響扦插條成活率等不足之處。
酶是具有生物催化作用的一類活性物質，同一屬、種不同品種間存在著不同形式的同工酶。同工酶作為基因表達的直接產物，可以直接反映出品種之間的基因差異，通過同工酶電泳技術顯示同工酶的不同譜帶，可用于物種之間、同一物種不同種群之間的遺傳差異鑒定、遺傳多樣性研究及物種起源進化等領域(王中仁，植物等位酶分析[M].北京科學出版社，1996)，現已廣泛應用于觀賞植物的品種鑒定研究。過氧化物酶(POD)是一種能利用雙氧水氧化供氫體的同工酶，對雙氧水的需求非常專一，在高等植物中廣泛而大量存在著，具有明顯的種屬、組織和發育階段特異性，在一定程度上反映植物的系統發生。由于過氧化物酶同工酶是基因表達的產物，因此對其酶譜的分析能夠很好地判斷基因的存在及其表達規律，能夠從分子水平上揭示物種的遺傳基礎。發明內容
為了解決簕杜鵑常規育種工作中存在的育種途徑少、育種效率低等問題，本發明提供一種簡單而高效的化學誘變育種方法。本發明具有處理成本低廉、方法簡便容易操作及突變頻率高等明顯優勢。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是
一種簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，包括如下步驟
取材選擇深紅色花系的母本，冬季取材；所述取材選取一年生向陽的簕杜鵑枝條，剪成10 12cm左右的扦插條，每個扦插條留2 4個芽。所述扦插條的生物學頂端用固體蠟封閉，下端削成楔形待用。
材料誘變處理將準備好的材料全部浸入誘變劑處理液中，密封放置在黑暗處，浸泡一定時間，保持一定的溫度；所述誘變劑為妝隊。所述妝隊為1-lOmmol/L。所述材料誘變處理中，浸入誘變劑處理液中的材料，浸泡時間為Mh，處理溫度為25°C。
誘變材料的扦插浸泡后的材料用流水沖洗，隨即扦插在溫室的育苗床中，控制溫濕度，保持一定的日光照射；所述誘變材料的扦插中浸泡后的材料用流水沖洗45min，扦插后的溫度控制在25-30°C，空氣濕度保持在60%以上，2000LUX的日光照射。
突變株的選擇種植50 60天后，通過與對照進行對比，選擇存活的葉色突變性狀，進行連續扦插繁殖，直至葉色突變性狀保持穩定；
確定新品系確定葉色突變性狀遺傳穩定的突變株為新品系。所述確定葉色突變性狀遺傳穩定的突變株為新品系的具體方法為對表型較為穩定的變異株進行同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，比較對照和變異株同工酶的酶譜，排除潛在的嵌合體，確定變異株表型性狀遺傳的穩定性，篩選出新品系。
利用化學誘變劑疊氮化鈉(NaN3)對簕杜鵑的扦插條進行浸泡處理，通過化學誘變產生變異株，然后利用連續扦插分離目的性狀的方式，創造出有利于目的性狀生長的時間和空間，即通過連續的世代選擇而獲得遺傳穩定的品系，達到化學誘變育種改良簕杜鵑品種的目的。
對選定的簕杜鵑母本扦插條進行確定濃度的化學誘變劑處理，通過連續扦插和世代選擇分離葉色突變性狀植株，最終選育出符合觀賞特性的育種中間材料。
其具體步驟如下
(1)取材選擇一年生向陽的簕杜鵑母本枝條，剪成10 12cm左右的扦插條，每個扦插條留2 4個營養芽。扦插條的生物學頂端用固體蠟封閉，下端削成楔形待用。
(2)緩沖液和誘變液的配制12g KH2PO4溶于IL蒸餾水中，然后用H3PO4調節pH 值至3. 0即為緩沖液；取不同體積數的lmol/L的NaN3原液溶于上述緩沖液，配制成1 IOmmol/L各濃度水平的誘變液。
(3)材料的誘變處理和扦插將上述材料全部浸入各濃度水平的誘變液中，密封黑暗中處理Mh，處理溫度25°C ；將經過誘變處理的材料置于流水中沖洗30 45min，立即進行扦插，扦插基質為泥炭土珍珠巖=1 1，控制溫度在25 30°C，空氣濕度保持在 60%以上，保持2000LUX的日光照射。
(4)表型突變株選擇與連續扦插繁殖在扦插后50 60日，比較對照(未被誘變處理)和誘變株在葉色性狀上的不同，選定突變的葉色性狀。選擇好目的性狀后，即可開始連續扦插繁殖，其作用在于分離葉色突變性狀。連續扦插繁殖的具體實施方式
為選擇突變株初生枝的基部(VM1R)作為扦插條進行繼代繁殖(VM2R),栽培措施同上；選擇VM2代的初生枝(仍舊保留目的性狀)基部作為扦插條進行繼代繁殖(VM3R),如此繼代繁殖，直至葉色突變性狀保持穩定。
實際育種工作中，兼顧成活數和突變率的變化，同時根據自己的育種目標，可以確定適宜比例的誘變劑濃度。選定目的性狀后，即可進行分離性狀的連續扦插繁殖。
對簕杜鵑不同母本的繁殖材料進行化學誘變處理(按照本文提供的方法)都可以實現葉色遺傳變異(通過大量、反復的試驗得以證明)，在實際操作中，可根據不同母本的繁殖材料調整處理劑量以達到取得目標優良變異單株的滿意效果。
(5) VM3代后變異株的蛋白質指紋圖譜檢測對表型較為穩定的變異株進行同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，比較對照和變異株同工酶(如過氧化物酶)的酶譜情況，排除潛在的嵌合體，確定變異株葉色突變性狀遺傳的穩定性，篩選出新品系。
本發明化學誘變利用高效的化學誘變劑進行處理，可以獲得較多的葉色突變，并且處理成本低，可以就地處理和栽培，簡單易行容易操作。
采用本方案能收到如下顯著效果
1、一次性可以就地處理大批母本材料，相對大大增加了變異株的基數。處理成本十分低廉，且能夠有效的縮短育種周期。
2、通過連續扦插的無性繁殖方式，保證突變體的生長具有競爭性，有利于克服嵌合體的產生，獲得穩定均一的變異植株。
3、采用NaN3對簕杜鵑母本扦插條進行誘變，能夠獲得較高頻率的葉色突變(半致死劑量的突變頻率達到70. 37% )，且變異譜較廣，有利于提高簕杜鵑品種的觀賞性。


圖1是分離目的性狀的連續扦插繁殖法示意圖。
圖2是葉色變異材料(VM3)代的蛋白質指紋圖譜。CK為對照，BN1-9為變異株。
圖3A是對照，圖;3B和圖3C是遺傳穩定的突變株BN6和BN7植株葉片情況。
具體實施方式
本發明采用如下具體實施方式
，以下實施例旨在說明本發明，而不是對本發明做限制。如無特別說明，均為常規方法(參考徐冠仁主編的《植物誘變育種學》，1996，第一版， 中國農業出版社和周延清等主編的《生物遺傳標記與應用》，2008，第一版，化學工業出版社)。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
(1)取材在深圳市中科院仙湖植物園科普實驗園的試驗苗圃中取一年生向陽的普通單瓣紫花簕杜鵑(Bougainvillea glabra choisy cv.)枝條，剪成10 12cm左右的扦插條，每個扦插條留2 4個營養芽。扦插條的生物學頂端用固體蠟封閉，下端削成楔形待用。
(2)緩沖液的配制取12g KH2PO4溶于IL蒸餾水中，用H3PO4調節pH值至3. 0。
(3) NaN3處理液的配制取1 IOml NaN3原液(lmol/L)溶于IL上述緩沖液中， 分別配成1. 25,2. 5,5. 0,10. Ommol/L共四個濃度水平的NaN3處理液。
(4)材料誘變處理將準備好的材料全部浸入上述不同水平濃度的NaN3處理液中，密封放置在黑暗處，浸泡Mh。
(5)誘變材料的扦插浸泡后的材料用流水沖洗45min，隨即扦插在溫室的育苗床中，溫度控制在25°C (25°C 30°C均可)，濕度保持在60%以上，保持2000Lux的日光照射。
(6)突變株的表型選擇和連續扦插繁殖55天(50 60天均可)后，選擇葉色發生變異(本試驗例中所選目的性狀)的扦插條進行移栽種植，重點觀察葉色有變異的植株。具體成活株數和突變率見表一(以葉色變異為例)，存活率(％ )=存活數/母本扦插數X 100 %，突變頻率(％ )=表型變異數/扦插條成活數X 100 %。表一為NaN3各濃度水平植株成活率及葉色變異數統計，可知，隨著誘變液濃度(劑量)的提高，成活數降低，但表型變異率卻提高了，因此在實際育種工作中，兼顧成活數和變異率的變化，同時根據自己的育種目標，可以確定適宜比例的誘變劑濃度。從表一看出，本發明優選誘變劑濃度為5. Ommol/ L。選定葉色變異性狀后，即可進行分離性狀的連續扦插繁殖。連續扦插繁殖的方式選擇突變株初生枝的基部(VM1R)作為扦插條進行繼代繁殖(VM2R)；選擇M2代的初生枝(仍舊保留目的性狀)基部作為扦插條進行繼代繁殖(VM3代)，如此繼代繁殖，直至目的性狀保持穩定。具體操作流程見圖1。
(7)VM3代后變異株的蛋白質指紋圖譜檢測對表型較為穩定的變異株進行同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。具體步驟采用BIO-RAD公司的ftOteau II xi cell垂直板電泳儀，過氧化物酶和酯酶的凝膠板制備參照周延清等的方法。點樣(樣品的制作方法: 取對照和供試變異株的幼嫩葉片各0. lg，加0. 05mol/L的Tris-Hcl (pH8. 8)緩沖液冰浴研磨，經6000r/min離心15min，取上清液，加入同體積的40%蔗糖，_20°C保存備用。)完畢后接通電源，初始電壓100V，0.證后加至200V。當溴酚藍指示劑移至距分離膠底部Icm時， 關閉電源停止電泳。過氧化物酶染色參照周延清等的方法，采用醋酸-聯苯胺染色法(周延清等，生物遺傳標記與應用[M].北京化學工業出版社，2008)。
從VM3代中選擇葉色變異較為穩定的9株變異株進行分析，比較對照和變異株過氧化物酶同工酶特征帶出現的情況，并進行統計，確定變異株目的性狀遺傳是否穩定，排除嵌合體的可能。試驗結果見圖2，圖2表明，本試驗例所選9株變異株，7株(Bm-BN5，和 BN8-BN9)均為嵌合體，2株(BN6和BN7)為實際發生變異的植株。圖中魚尾箭頭即BN6所示為缺失特征帶，另一箭頭即BN7所示為新增特征帶，說明BN6和BN7均發生了變異，是新品系，可進一步培育成品種。實際發生變異的BN6和BN7的圖片資料見圖3，BN6葉面表現較為均勻的缺綠狀態，葉斑點淺黃色，特點是主要葉脈不缺綠；BN7葉面則呈不規則的大塊黃斑，且分布不均勻，在斑塊區域的葉脈顏色與斑塊顏色一致。
表一
權利要求
1.一種簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，包括如下步驟取材選擇深紅色花系的母本，冬季取材；材料誘變處理將準備好的材料全部浸入誘變劑處理液中，密封放置在黑暗處，浸泡一定時間，保持一定的溫度；誘變材料的扦插浸泡后的材料用流水沖洗，隨即扦插在溫室的育苗床中，控制溫濕度，保持一定的日光照射；突變株的選擇種植50 60天后，通過與對照進行對比，選擇存活的葉色突變性狀，進行連續扦插繁殖，直至葉色突變性狀保持穩定；確定新品系確定葉色突變性狀遺傳穩定的突變株為新品系。
2.權利要求1所述的簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，所述取材選取一年生向陽的簕杜鵑枝條，剪成10 12cm左右的扦插條，每個扦插條留2 4個芽。
3.權利要求2所述的簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，所述扦插條的生物學頂端用固體蠟封閉，下端削成楔形待用。
4.權利要求1所述的簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，所述誘變劑為NaR。
5.權利要求4所述的簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，所述Ni^3濃度為 1-lOmmol/Lo
6.權利要求1所述的簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，所述材料誘變處理中，浸入誘變劑處理液中的材料，浸泡時間為Mh，處理溫度為25°C。
7.權利要求1所述的簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，所述誘變材料的扦插中浸泡后的材料用流水沖洗45min，扦插后的溫度控制在25-30 °C，空氣濕度保持在60 %以上，2000LUX的日光照射。
8.權利要求1所述的簕杜鵑的化學誘變育種法，其特征在于，所述確定葉色變異性狀遺傳穩定的突變株為新品系的具體方法為對表型較為穩定的變異株進行同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，比較對照和突變株同工酶的酶譜，排除潛在的嵌合體，確定變異株目的性狀遺傳的穩定性，篩選出新品系。
全文摘要
一種簕杜鵑的化學誘變育種法，本發明涉及木、藤本植物的無性繁殖和化學誘變育種領域。采用疊氮化鈉NaN3對簕杜鵑的扦插條進行處理，利用連續扦插繁殖，創造出有利于葉色突變體生長的時間和空間，通過世代選擇而獲得遺傳穩定的具有觀賞價值的新品系，達到化學誘變育種的目的。該技術方案能一次性就地處理大批母本材料，相對大大增加了變異株的基數，突變頻率高，且處理成本相對低廉，能夠有效的縮短育種周期。利用連續扦插的繁殖方式，保證葉色突變體的生長具有競爭性，有利于克服嵌合體的產生，獲得穩定均一的變異植株。該方案能夠獲得較高頻率的突變，且變異譜較廣，有利于簕杜鵑品種的改良。
文檔編號A01H1/06GK102499071SQ20111042027
公開日2012年6月20日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者劉偉, 陳庭 申請人:深圳市仙湖植物園管理處