專利名稱：培育抗病水稻的方法及其專用載體和啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種培育抗病水稻的方法及其專用載體和啟動子。
背景技術：
水稻作為重要的糧食作物之一，為世界上一半以上的人口提供食物來源。水稻種植面積約占全國耕地面積的1/4，年產量將近占全國糧食總產的1/2。水稻病害一直嚴重影響水稻的生產。水稻病害的種類很多，全世界有近百種，我國正式記載的達70余種，有經濟重要性的有20余種，其中稻瘟病、紋枯病和白葉枯病發生面積大、流行性強、危害嚴重，是水稻上的“三大重要病害”。以水稻白葉枯病為例，田間常在分蘗期觀察到病癥，并隨植株的生長而發展，至抽穗期達到高峰。水稻遭受白葉枯病后，一般減產20-30%，嚴重時甚至絕收。不斷提高水稻產量、品質及抗病性，為保障國家糧食安全和農業可持續發展有重要意義。目前應對農作物病害的主要手段是培育抗病品種和化學農藥防治。然而現有的水稻抗病品種存在育種周期長、抗性喪失快等重大技術障礙，化學農藥的施用對環境造成嚴重污染。從植物本身進一步挖掘抗病基因資源，可為應對水稻重大病害及不斷產生的新病害提供抗病育種的新手段和新策略。目前，水稻中已定位30多個稻瘟病抗性位點和25個白葉枯病抗性位點。抗性基因(R基因)介導的抗病性水平高，常表現高抗，是抗病基因工程中常用的抗病基因。但R基因和病原菌avr基因的·互作表現為品種對小種的專化性抗性，所以R基因介導的水稻抗病性常因病原菌群體生理小種的變化而喪失。在真核生物中廣泛存在的非編碼小 RNA (nonconding small RNAs)包括 miRNAs (microRNAs)和 siRNA (short interferingRNAs)，可以通過對靶標RNA的剪切或翻譯抑制，以及DNA或染色體的甲基化等調控靶標基因的表達。miRNA由非編碼核基因轉錄而來，其基因多定位于基因之間的間隔區，也有一些位于基因的內含子區域，有些成族存在。對已測序的生物的基因組研究發現，越聞等的生物其基因間隔區所占比例越大。越來越多的研究表明，這些非編碼小RNA參與了生物的生長發育和抗病應答過程。系統分析植物中參與這些應答過程的小RNA,并根據小RNA對應的革巴標基因分析靶標基因參與的代謝途徑，為進一步應用小RNA調控植物抗病打下基礎。大量的研究表明小RNA介導的基因沉默是植物和動物抵抗病毒侵染的重要分子機制。最新的研究表明，小RNA也參與了植物抗細菌的基礎免疫反應。因此，小RNA為開發新的水稻抗病途徑提供良好的基因資源。miRNA序列在擬南芥和水稻之間相對保守，但水稻中也存在其特異的miRNA，這可能暗示在水稻中存在特異的小RNA參與的基因調控網絡；siRNA的種類多樣，在不同物種之間的保守性不強，其功能尚未完全闡述清楚，但已有研究發現假單胞菌(Pseudomonassyringae)可以誘導擬南芥內源siRNA表達,并且siRNA在植物免疫中同miRNA—樣有重要的調節功能。對水稻小RNA抗病基因資源的挖掘不但在植物抗病機理的研究上可能有新的重大發現，更重要的是分離鑒定對水稻抗病/植物免疫中有潛在應用價值的小RNA，可為水稻抗病育種提供擁有自主知識產權基因資源，建立水稻抗病育種的新策略。目前已發現內源小RNA廣泛參與了植物形態建成、開花、根系發育、激素應答和抗脅迫反應等重要相關基因的表達調控。植物內源小RNA(small RNA)主要包括miRNA和siRNA兩類。siRNA又分為主要的四類，分別為內源性siRNA (natural antisense siRNA,nat-siRNA)、反式作用 siRNA(trans-acting short interfering RNAs, tasiRNAs)、異染色質 siRNA (heterochromatic si RNAs, he si RNAs)和長 siRNA(long siRNA, IsiRNA)。不同的Dicer酶切割不同的底物產生21-30nt的小RNA，而miRNA和siRNA均能與特異的AGO(Argonaute)蛋白結合形成 RTSC 復合物(RNA-1nduced silencing complexes),并作用于不同的靶標基因，引起小RNA介導的基因沉默。水稻中有8個類Dicer (OsDCLs)、19個ARG0NAUTE 蛋白(OsAGOs)和 5 個依賴 RNA 的 RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,OsRDRs)。siRNA來源于入侵核酸或病毒復制形成的雙鏈RNA，這些外源siRNA介導的RNA沉默是一種被動的防御機制；而在染色體上發現的內源性的siRNA則是細胞主動利用RNA沉默機制。最近的研究表明，在植物與病原細菌互作過程中，內源的小RNA也參與了植物抗細菌的基礎免疫反應。研究者已經成功鑒定了兩個植物病原細菌的病原相關分子模式PAMP(pathogen-associated molecular pattern)及其特異性的模式識別受體(patternrecognition receptor),即鞭毛蛋白片段f lg22 (其受體為激酶FLS2)和延長因子EF-TU (其受體為EFR)。其中，flg22可被水稻受體0sFLS2所識別已經獲得實驗證實。有意義的是，目前研究發現擬南芥的micr0RNA393會被flg22特異性地誘導，隨后micr0RNA393介導了植物生長素受體基因TIR1，AFB2和AFB3mRNA的降解，使生長素信號途徑受到抑制。又如，擬南芥miRNA途徑關鍵基因DCLl和Henl突變的dcll_9和henl_l突變體，會表現出一定程度的免疫缺損，III型分泌系統突變的Pseudomonas syringae pv.tomato (Pto)DC3000 hrcC-病原菌，雖然不能分泌毒性蛋白因子，但在dcll_9和henl_l突變體上PtoDC3000 hrcC-和野生型Pto DC3000病原菌使上述兩個擬南芥突變體都感病，miRNA途徑的破壞甚至導致非寄主病原(如E.coli和P.fIuorescens)對擬南芥的侵染。miRNA途徑可能是植物基礎抗性的重要組成部分。進一步研究表明病原細菌(P.syringae)的效應蛋白AvrPtoB可通過抑制擬南芥pr 1-microRNA393的轉錄,從而抑制植物由細菌的效應蛋白引發的免疫反應，即 ETI (effector-triggered immunity)途徑。啟動子是調控基因表達的重要元件，是生物遺傳操作中必要因素，對于基因功能的研究和轉基因育種都具有重要價值。組成型啟動子是應用較為廣泛的啟動子，多用于基因的過量表達，沒有時間和空間的特異性；而誘導型啟動子則因具有應答特異刺激下表達的特點而被應用在光、熱、創傷、病原、激素等生物誘導或非生物逆境脅迫(干旱、高鹽、低溫等)條件下表達；組織特異性啟動子在根、葉、花、果實等特定組織中表達。組織特異性啟動子和誘導型啟動子較組成型啟動子在應用上的優勢在于，只在特定時空表達而避免過度損耗能量，有利于平衡植物生長發育與應答逆境的關系。因此，挖掘誘導型或組織特異性啟動子元件，轉基因分子設計育種都具有重要作用。植物抗病基因工程所首選的最佳目的基因是來自植物自身的抗病基因，包括參與抗病功能調控的小RNA。利用病原誘導型的啟動子驅動抗病相關的小RNA表達是較為理想的策略。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種培育抗病轉基因植物方法。本發明提供的方法，為將micix)RNA393的編碼基因及驅動其表達的誘導型啟動子導入目的植物，獲得轉基因植物；所述轉基因植物的抗病性高于所述目的植物。上述方法中，所述誘導型啟動子為如下I)或2):I)由單順式調控元件和CaMV35S啟動子組成；2)由雙順式調控元件和CaMV35S啟動子組成；所述microRNA393的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述單順式調控元件的核苷酸序列為序列I的自5’末端第1-66位核苷酸；所述雙順式調控元件的核苷酸序列為序列2的自5’末端第1-114位核苷酸；所述CaMV35S啟動子的核苷酸序列為序列I的自5’末端第67-178位核苷酸或序列表中序列2自5’末端第115-226位核苷酸；上述micix)RNA393的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。上述方法中，所述micr0RNA393的編碼基因及驅動其表達的誘導型啟動子通過植物表達載體導入所述目的植物；所述植物表達載體為如下a)或b):
a)為將序列表中的序列I插入1300-DAS的中，得到表達microRNA393的載體；b)為將序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表達microRNA393的載體。上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。上述方法中，所述轉基因植物的抗病性高于所述目的植物是在引發所述病的病原菌誘導下產生的；所述病具體為水稻白葉枯病，所述水稻白葉枯病的病原菌具體為水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)。本發明的另一個目的是提供一種重組載體。本發明提供的重組載體，為如下a)或b):a)為將序列表中的序列I插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位點中，得到表達microRNA393的載體；b)為將序列表中的序列2插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位點中，得到表達microRNA393的載體。本發明的第三個目的是提供一種DNA分子A。本發明提供的DNA分子A，為如下1)-4)中的任--種:I)序列表的序列I自5’末端第1-66位核苷酸所不的DNA分子；2)序列表的序列2自5’末端第1-114位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)所述DNA序列雜交且具有同樣功能的DNA分子；4)與I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有同樣功能的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2X SSC，0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。本發明的第四個目的是提供一種DNA分子B。本發明提供的DNA分子B，為如下為如下1)_4)中的任--種:I)序列表的序列I自5’末端第1-178位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列2自5’末端第1-226位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；4)與I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2X SSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。上述的DNA分子A或上述的DNA分子B在啟動目的基因在植物中表達的應用。在上述應用中，所述目的基因為microRNA393或GUS (genbank號gb I S69414.1)；所述microRNA393的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。本發明的實驗證明 ，本發明提供的培育轉基因植物的方法，為將含有誘導型啟動子和micix)RNA393的重組載體轉化水稻，得到的轉基因水稻在病原侵染過程中才啟動microRNA393基因表達，可以實現抗水稻白葉枯病菌的目的，避免microRNA393過表達及對轉基因植物本身的不利影響。本發明的顯著優點為在單子葉植物中抗病育種中具有重要的應用價值。本發明提供的誘導型啟動子為WRKY家族轉錄因子結合位點順式元件(ATCGTTGACCGAGTTGACTTTATCGTTGACCGAGTTGACTTT)與 CaMV35S mini 啟動子-89 +1 (TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGA)序列融合,構建成單倍順式元件和雙倍順式元件分別與CaMV35S mini啟動子組成的誘導型啟動子驅動microRNA393表達的植物表達載體。


圖1為包含CaMV35S_89mini啟動子的植物表達載體pBI_89的結構示意2為轉⑶S基因水稻染色實驗圖3為中間載體pl300-DAS的結構示意圖
圖4為質粒構建過程簡5為轉基因水稻抗病實驗
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、啟動子的獲得I)設計引物引物序列如表1:表I為引物序列
權利要求
1.一種培育抗病轉基因植物的方法，為將miCix)RNA393的編碼基因及驅動其表達的誘導型啟動子導入目的植物，獲得轉基因植物；所述轉基因植物的抗病性高于所述目的植物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述誘導型啟動子為如下I)或2): 1)由單順式調控元件和CaMV35S啟動子組成； 2)由雙順式調控元件和CaMV35S啟動子組成； 所述microRNA393的核苷酸序列為序列表中的序列3 ； 所述單順式調控元件的核苷酸序列為序列I的自5’末端第1-66位核苷酸； 所述雙順式調控元件的核苷酸序列為序列2的自5’末端第1-114位核苷酸； 所述CaMV35S啟動子的核苷酸序列為序列I的自5’末端第67-178位核苷酸或序列表中序列2自5’末端第115-226位核苷酸； 所述microRNA393的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述micr0RNA393的編碼基因及驅動其表達的誘導型啟動子通過植物表達載體導入所述目的植物； 所述植物表達載體為如下a)或b): a)為將序列表中的序列I插入1300-DAS的中，得到表達microRNA393的載體； b)為將序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表達microRNA393的載體。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: 所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述轉基因植物的抗病性高于所述目的植物是在引發所述病的病原菌誘導下產生的； 所述病具體為水稻白葉枯病，所述水稻白葉枯病的病原菌具體為水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)。
6.一種重組載體，為如下a)或b): a)為將序列表中的序列I插入1300-DAS的中，得到表達microRNA393的載體； b)為將序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表達microRNA393的載體。
7.一種DNA分子A，為如下I)-4)中的任--種: 1)序列表的序列I自5’末端第1-66位核苷酸所不的DNA分子； 2)序列表的序列2自5’末端第1-114位核苷酸所不的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)所述DNA序列雜交且具有同樣功能的DNA分子； 4)與I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有同樣功能的DNA分子。
8.一種DNA分子B，為如下I)-4)中的任--種: 1)序列表的序列I自5’末端第1-178位核苷酸所不的DNA分子； 2)序列表的序列2自5’末端第1-226位核苷酸所不的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)所述DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子； 4)與I)或2)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
9.權利要求7所述的DNA分子A或權利要求8所述的DNA分子B在啟動目的基因在植物中表達的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于: 所述目的基因為microRNA393或⑶S ； 所述microRNA393的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的 序列2自5’末端第227-364位核苷酸。
全文摘要
本發明公開了一種培育抗病水稻的方法及其專用載體和啟動子。本發明提供的方法，將microRNA393的編碼基因及驅動其表達的誘導型啟動子導入目的植物，獲得轉基因植物；所述轉基因植物的抗水稻白葉枯病高于所述目的植物；所述誘導型啟動子為如下1)或2)1)由單順式調控元件和CaMV35S啟動子組成；2)由雙順式調控元件和CaMV35S啟動子組成。本發明的實驗證明，本發明提供的培育轉基因植物的方法，為將含有誘導型啟動子和microRNA393的重組載體轉化水稻，得到的轉基因水稻在病原侵染過程中才啟動microRNA393基因表達。
文檔編號A01H5/00GK103194484SQ20121000421
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者方榮祥, 賈燕濤, 陳曉英, 郭萍 申請人:中國科學院微生物研究所