專利名稱：蘇云金芽胞桿菌cry1Ca基因，表達蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物防治技術領域，特別是進一歩，本發明涉及對鱗翅目害蟲具有高毒力的Bt crylCa基因及由該基因所編碼的蛋白質。
背景技術：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是ー種分布廣泛的革蘭氏陽性細菌，是ー種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。Bt在芽胞形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)， 也稱δ-內毒素(delta-endotoxin)，它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關系 [Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R., Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998,62(3) :775-806.]。自 1981 年 khn印f 等克隆了 Bt 的第一個 ICPs 基因，并于1985年發表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，目前(2011年10 月)已發現種殺蟲晶體蛋白605種，被分為70類cry蛋白和2類cyt蛋白。當今，采用噴施化學農藥防治手段固然可以減輕害蟲對農作物的為害，但化學農藥造成環境污染，長期以來，大量噴施化學殺蟲劑，不僅會增強害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態區系遭受破壞， 而且嚴重污染環境，提高生產成本，破壞生態平衡。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優點而被廣泛的應用于蟲害防治。蘇云金芽胞桿菌除了直接作為生物農藥以外，1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲準應用，它使用的基因來自Bt cryIAc。在接下來的幾年里，轉cryIAb基因的抗蟲玉米，轉cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/cryIAb基因的抗蟲棉以來，已經被普遍種植。在轉基因作物商業化的第一個12年(1996-2007)中，由于能得到持續穩定的收益， 農民種植轉基因作物量逐年増加。2010年，25個國家種植了轉基因作物，全球轉基因作物累計種植面積超過十億公頃，19個為發展中國家，排名前十位的國家種植面積都超過100 萬公頃，其中，有8個是發展中國家，90%都是小型農戶。同吋，有30多個國家新近批準種植轉基因作物，日本、新加坡等國家批準進ロ轉基因農作物。總的來說，已經有59個國家同意種植或進ロ轉基因產品，中國則批準了所有的商業化生物技木，2010我國種植轉基因作物350萬公頃，排世界第六。轉基因作物商業化給エ業化國家和發展中國家的農民都帶來了經濟和環境效益。蘇云金芽胞桿菌及其基因發掘已成為可持續發展農業中重要課題。由于目前商品化的轉基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基因組合來避免害蟲抗藥性上升的風險。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因，可以豐富殺蟲基因資源，為轉基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉基因產品的抗蟲效果，并且可以降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要的經濟、社會和生態效益。

發明內容
本發明提供ー種對鱗翅目害蟲小菜蛾、甜菜夜蛾高毒力的蘇云金芽胞桿菌 LB-R-78，及其殺蟲新基因CrylCal3基因和其晶體殺蟲蛋白，以應用于轉化微生物和植物， 使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78，其保藏編號為CGMCC No. 5567。蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78在殺殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾中的應用。殺蟲蛋白CrylCal3，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。crylCal3基因，編碼殺蟲蛋白CrylCal3。優選其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。ー種表達載體，其特征是含有crylCal3基因。所述表達載體為pEB-crylCa，其骨架載體為pEB，其結構如圖6所示。所述表達載體為pSTK-crylCa，其骨架載體為pSTK，其結構如圖7所示。ー種微生物轉化體，其特征是含有crylCal3基因。crylCal3基因在殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾害蟲中的應用。所述應用是將CrylCal3基因表達的蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分。本發明從遼寧千山圓通觀附近土壌中分離得到一株蘇云金芽胞桿菌菌株 LB-R-78，其保藏編號為CGMCC No. 5567，該菌株生物學特性為在生長周期中可以產生芽胞， 并且同時產生有毒殺鞘翅目害蟲作用的伴胞晶體，其對小菜蛾具有很強的殺滅能力；從該菌株中得到ー個新基因的陽性克隆，即pEB-crylCa (見圖6)，對其進行測序分析，發現克隆 crylCa中含有3573個堿基，見SEQ ID NOl，編碼1191個氨基酸，見SEQ ID N02。與已發表的基因相比，與crylCa5相似性最高，相差5個氨基酸；從上述陽性克隆提取質粒，轉入受體菌，得到表達菌株，測定基因的表達蛋白的活性，基因crylCa表達的蛋白對小菜蛾，甜菜夜蛾的初篩生測結果為校正死亡率為100%，見表1。crylCal3基因可按生物技術的常規方法轉化微生物、植物，表現出對相關鱗翅目害蟲的毒性。將上述基因轉化菌株，表達得到的蛋白可以制成生物農藥用于殺死鱗翅目害蟲。 同吋，可以轉入植物構建抗蟲轉基因植物，用于害蟲的防治。本發明分離克隆的Bt crylCal3基因序列及其基因表達產物能夠對鞘翅目害蟲產生強毒力，特別是對小菜蛾有高活性，是很好的生物殺蟲基因，有很廣泛的應用前景。通過該crylCal3基因與crylAc、cryIAb, crylBa、cry2Ab等基因表達產物組合，可擴大對鱗翅目害蟲的蟲譜。通過應用于轉化微生物和植物，使它們表現出對相關害蟲的毒性，可克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。菌株保藏信息菌種分類命名蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏日期2011年12月12日保藏編號CGMCCNo. 556

圖1光學顯微鏡下觀察菌株LB-R-78菌體的形態，圖2電鏡下菌株LB-R-78菌體形態圖3含有目的基因的基因組PCR鑒定，其中1 菌株 LB-R-78PCR-RFLP 結果，2 菌株LB-R-78PCR擴增產物M =Marker (100, 200、500、750、1000、2000bp)圖4crylCal3基因全長PCR結果M :Marker(300、500、800、1500、2000、3000、5000bp)，1 :pEB_crylCa質粒 DNA 的 Sal I 消化產物；2 :pEB-crylCa 質粒 DNA 的 Sma I/Sal I 消化產物；3 :pEB_crylCa 質粒 DNA 3. 6kb全長擴增產物；4，5 :pSTK-cry ICa酶切圖譜圖5crylCal3基因在大腸桿菌中表達蛋白的SDS-PAGE其中a為pEB-crylCa重組質粒的表達，b為pSTK-crylCa重組質粒的表達。M 蛋白高分子量 marker (200，116，97，66，44kDa)，1 :IPTG 誘導的 pEB-crylCa 可溶組分；2 =IPTG誘導的pEB空載體可溶組分；3 =IPTG誘導的pEB-crylCa非可溶組分；4 IPTG誘導的pEB空載體非可溶組分；5，6 =BSA ；7 :pSTK-crylCa重組質粒在Bt無晶體突變株中的表達圖6pEB_crylCa結構示意圖，圖 7pSTK_crylCa 結構示意圖。
具體實施例方式實施例1、分離得到蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78本申請人的實驗室工作人員從黑龍江省五常市拉林鎮附近土壌中分離的得到一株蘇云金芽胞桿菌，蘇云金芽胞桿菌的芽胞由外向內依次為芽胞外壁、芽胞衣、皮層、芽胞內壁，原生質膜和原生質體。其中皮層的主要成分是肽聚糖，不含營養細胞的多聚糖磷壁酸，它保持著芽胞的脫水狀態和耐熱性，另ー方面，芽胞形成過程中，會產生大量DPA-Ca 鰲合物，使得芽胞中的生物大分子形成耐熱凝膠，在80°C下熱處理20min，蘇云金芽胞桿菌芽胞也不會死亡并且休眠的芽胞在75°C的亞致死溫度下處理15min，活化效果最好，不但促其快速萌發，還可提高芽胞的成活率(喻子牛1990)。依據這ー特性，可實施溫度篩選(Knowles B H, Ellar D J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis d-endotoxins with different specificity[J]. Biochimica et biophysica acta, 1987,924 :509-518.；戴蓮音與，王學聘等.中國八個自然保護區森林土壤中蘇云金芽胞桿的分布[J].微生物學報，1994， 30(2) 117-121)。1、1菌株的分離1)取分裝的土樣加入到50ml大離心管中，至錐形管錐形處。2)加滅菌水至15ml處，放入玻璃珠5 10顆。3)用振蕩器將土樣打碎。4)放入水浴鍋中80°C，20分鐘。5)取1. 5ml的EP管，每個管中加Iml滅菌水，再從50ml管中取10微升菌液加入到EP管中混勻。6)從EP管中取100微升噴到1/2LB培養基中，涂勻。7)放入到30°C溫箱中培養2 3天。8)鏡檢觀察。晶體觀察光學顯微鏡將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復紅染液染色;3min， 清水沖洗，IOOx油鏡進行鏡檢，石炭酸復紅染液配制方法參見文獻(Baroy F，Lecadet M M, Deieluse A. Cloning and sequencing οι three new putative toxin genes from Clostridium bifermentans [J]. Gene, 1998,211 :293-295)。見圖 1 所示。在 1/2LB 培養基上培養4 后形成單菌落，光學顯微鏡下觀察到菌株LB-R-78菌體為長桿狀，芽胞為長圓棒狀，晶體為雙錐形。電鏡顯微觀察掃描電鏡制樣孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，經鋨酸固定，而后經酒精梯度脫水，臨界點干燥，離子濺射噴金Onm厚)，NewBiO-TEMH-7500掃描電鏡觀察拍照。如圖2所
7J\ ο生物學測定表明，對小菜蛾、甜菜夜蛾的初篩生測結果為校正死亡率為100%。實施例2.獲得新基因2. 1利用cryl類基因通用引物檢測菌株LB-R-78，引物如下
權利要求
1.蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78，其保藏編號為CGMCCNo. 5567。
2.蘇云金芽胞桿菌菌株LB-R-78在殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾中的應用。
3.殺蟲蛋白CrylCal3，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
4.crylCal3基因，編碼殺蟲蛋白CrylCal3。
5.權利要求4所述的crylCal3基因，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
6.ー種表達載體，其特征是含有權利要求4或5所述的CrylCal3基因。
7.權利要求6所述的表達載體為pEB-crylCa，其骨架載體為pEB，其結構如圖6所示； 或者所述表達載體為pSTK-crylCa，其骨架載體為pSTK，其結構如圖7所示。
8.—種微生物轉化體，其特征是含有權利要求4或5所述的crylCal3基因。
9.權利要求4或5所述的CrylCal3基因在殺滅小菜蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾害蟲中的應ο
10.權利要求9所述應用，是將權利要求4或5所述的CrylCal3基因表達的蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分。
全文摘要
本發明涉及“蘇云金芽胞桿菌cry1Ca13基因，表達蛋白及其應用”，屬于生物防治技術領域。殺蟲蛋白，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，及編碼該殺蟲蛋白的基因，優選所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。上述基因對鱗翅目害蟲具有高毒力，以應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。
文檔編號A01N47/44GK102559554SQ20121000411
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者劉榮梅, 宋福平, 張 杰, 李海濤, 高繼國 申請人:東北農業大學