專利名稱：一種色木槭腋芽途徑組織培養的方法
技術領域：
本發明涉及色木槭(Acer mono Maxim)組織培養繁殖方法，屬于木本植物種苗繁殖的技術領域。
背景技術：
色木槭(Acer mono Maxim)屬槭樹科(Aceraceae)槭樹屬(Acer)植物。又名五角槭，落葉喬木，高15-20m ；樹皮粗糙，?？v裂，灰褐色；小枝細瘦，無毛，當年生嫩枝綠色或紫綠色，多年生枝灰色或淡灰色，具圓形皮孔；冬芽近于球形，鱗片卵形。葉對生葉柄長 4-6cm,細瘦，無毛；葉片紙質，外貌近橢圓形，長6-8cm，寬9-llcm，5裂，有時3裂及7裂同生一樹；裂片卵形或寬三角形，長漸尖，全緣，無毛，僅主脈腋間有簇毛，主脈5條，在上面顯著，側脈兩面均不顯著，上面光綠色，下面淡綠色。花多數，雜性，雄花與兩性花同株，多數常成圓錐狀，傘房花序頂生，無毛；花帶綠黃色，總花梗長l-2cm;萼片5，長圓形，黃綠色；花瓣 5，橢圓形，淡白色；雄蕊8，無毛，比花瓣短，花藥黃色；子房無毛，在雄花中不發育，花柱無毛，柱頭2裂，反卷。翅果嫩時紫綠色，成熟時淡黃色，小堅果壓扁狀，長1-1. 3cm,寬5-8mm ； 翅長圓形，寬5-10mm，連同小堅果長2_2. 5cm,張開成銳角或近于鈍角，花期5月，果期9月。 主要自然分布于東北、華北、華中、華東、西南各地。由于色木槭樹勢優美，枝葉濃密，葉形秀麗，嫩葉紅色，入秋變成橙黃或紅色，甚為美觀。因此，該樹種無論栽植于何處，無不感到引人入勝，在園林中既可以作為很好的有色樹種植于草坪、土丘、溪邊、池畔等地，又可以作為行道樹利用。此外，色木槭木材紋理清晰，結構細而均勻，木質重、硬、耐腐，易加工，切面光滑，彈性好，是制作高檔家具、樂器、農具和膠合板的上好材料。目前國內對色木槭的研究與開發應用較少。對于其快速繁殖和栽培管理的研究尚處于空白。色木槭目前以種子繁育為主，相關研究表明色木槭靠種子繁殖的實生苗變異比較大，形狀不穩定，因此市場上種苗資源極其短缺。扦插與嫁接還在試驗之中，槭樹科種子飽滿率極低，僅萬分之幾。這樣不僅繁殖系數小，而且成苗時間大大延長，很難形成規模，， 滿足不了市場的需求。木本植物組織培養研究起步于20世紀50年代初，直到70年代后期才得到較大的發展。組織培養獲得再生植株主要分為兩種途徑，其一為廣義組織培養，即從植物體分離出符合需要的器官等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養以獲得再生的完整植株；其二為狹義組織培養，即在培養過程中從各器官上產生愈傷組織，培養愈傷組織再經過再分化形成再生植物。目前，不完全統計有90多屬300多種木本植物經組織培養獲得再生植株。而關于槭樹屬植物組織培養的研究，國內外報道很少。近5年，僅見有報道對色木槭嫩莖(見植物生理學通訊，2008年第2期，色木槭的組織培養及快繁技術)、對紅翅槭以嫩莖(見北方園藝，2010年第9期，紅翅槭的組織培養及快繁技術)和嫩葉(見中南林業科技大學學報， 2010年第4期，景觀樹種紅翅槭愈傷組織誘導培養)為外植體進行愈傷組織的誘導培養，而關于色木槭的腋芽(器官)途徑離體快繁研究尚未見有報道。
綜上所述，采取組織培養繁殖色木槭是解決色木槭資源短缺的重要途徑之一，對色木槭的開發和推廣利用都具有著非常重要的意義。

發明內容
本發明主要解決的技術問題是公開色木槭的腋芽途徑組織培養繁殖方法。為解決該技術采用如下的技術方案A)外植體消毒9月中上旬取色木槭一年生扦插苗當年生枝條上帶腋芽的莖段為外植體，用清水沖洗干凈，清洗后放入質量濃度為3%的H202中浸泡15 20分鐘，取出立即轉入含質量濃度為1 5%吐溫-80的0. 1% HgCI2溶液中浸泡10 20分鐘，然后取出用無菌水沖洗5 6次并用滅菌吸水紙將水吸干。B)腋芽萌動取消毒后的外植體切割為1. 0-1. 5cm長的莖段，其中每個莖段帶一個腋芽，將蓬段接種于誘導培養基 WPM+6-BA1. 0mg/L+IBA0. 01mg/L+PVP500mg/L+GA3l. Omg/ L PH6. 0中進行腋芽的萌發誘導，控制培養溫度在25°C，進行光照培養20d，所述光照培養為光照時間10_16h/d，光照強度為1600-20001x ；C)繼代培養將步驟B)中所得色木槭嫩梢切割后接入繼代培養基 WPM+6-BA0. 3mg/L+IBA0. 05mg/L+PVP500mg/L PH6. 0 中進行繼代培養 30d,培養溫度 25°C， 光照時間10-16h/d，光照強度為1600-20001x ；D)根的誘導將步驟C)所得色木槭試管苗接入生根培養基1/2MS+IBA3. Omg/ L PH6.0中進行生根培養15-20d，培養溫度2046°C，光照時間10_16h/d，光照強度為 1600-2000Ix。E)無菌苗馴化及繼續培養將步驟D)所得色木槭生根無菌苗在打開瓶蓋的環境下培養3-5d，然后移入適合該樹種生長環境的輕基質容器中繼續培育，輕基質是由土壤、 河沙和有機肥以2 1 2的比例混合而成，并用0.4%的高錳酸鉀消毒，培育10-15天后將苗木與基質一起移栽并密植到所適應的土壤中繼續培育。本發明相對現有技術的有益效果為1、本發明在試驗過程中發現，按常規的操作滅菌后外植體被殺傷，不能得到誘導培養所需的有效外植體數。經反復試驗，多次實驗結果的比較，才得到本發明的具體實施方案，即流水沖洗-雙氧水-升汞，不僅得到了理想的滅菌效果，還保證了誘導培養所需的外植體數。這一結果與發明所針對的特定對象色木槭所含成分有很大關系。本發明采用色木槭外植體滅菌方法是在理論研究的基礎上，得到大量試驗結果支持的有效滅菌方法。2、由于不同的植物，根系生長方式和長度不一樣，扎根能力不一樣，因此不同的基質層對植物的生根率有很大的影響。本發明將一次生根后的試管苗移入由土壤、河沙、有機肥構成的輕基質中繼續培育，進行二次生根，大大提高了生根率，進一步提高了色木槭的成活率。二次生根與一次生根不同，由于一次生根后的穗條根系比較發達、粗壯，吸收能力高， 所以本發明根據此特點，為色木槭的生根配制出營養成分較高的輕基質，同時用高錳酸鉀對輕基質進行消毒，可避免其中的有害成分對苗木生長造成影響。3、采用腋芽途徑組織培養的方法對色木槭進行繁殖，配合最佳的誘導、繼代、生根培養基配方，能夠有效的得到大量的色木槭無菌苗，解決色木槭資源短缺的問題；通過對外植體、誘導培養基、繼代培養基及生根培養基的選取，能夠使得增殖率達到70倍，馴化成活率達到98-100%，高效的得到色木槭種苗。
具體實施例方式實施例一1、選取10株茁壯的色木槭一年生扦插苗。于2010年1月份休眠期放入溫室培養。2010年9月1日，剪取當年生帶腋芽莖段，去除葉片，保留Icm葉柄，以腋芽為外植體， 每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，清洗后放入質量濃度為3%的H202 中浸泡15 20分鐘，取出立即轉入含質量濃度為1 5%吐溫-80的0. 1% HgCI2溶液中浸泡10 20分鐘，然后取出用無菌水沖洗5 6次并用滅菌吸水紙將水吸干。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0. 5cm,以去除受傷部分。接入誘導培養基WPM+6-BA1. Omg/ L+IBAO. 01mg/L+PVP500mg/L+GA3l. Omg/L PH6. 0 中。每瓶接 3 株，共接入 30 瓶。在溫度 25°C，光照時間10h/d，光強20001x的條件下，進行培養。2、外植體接入培養基4d后，外植體開始有腋芽萌動。至20d時，萌發率達95%， 共獲得86株不帶根的初代無菌苗。無菌苗株高約km，每株莖上帶有已萌動的腋芽2至4 個。將葉片去除，主干切為帶芽莖段，每段帶一個腋芽，共取170段。接入繼代增殖培養基 WPM+6-BA0. 3mg/L+IBA0. 05mg/L+PVP500mg/L PH6. 0 中，培養條件同上。培養 IOd后，腋芽開始陸續出梢，15d后枝條開始硬化，腋芽開始飽滿，30d后，170個腋芽的萌發率達到98%，增殖率達到3. 8倍，即每株繼代苗上平均含有3. 8個腋芽，共得到腋芽633個。3、將繼代的無菌苗切成帶2-3個腋芽的小段，接入生根壯苗培養基 1/2MS+IBA3. 0mg/LPH6. 0，共接入600株，培養條件同上。培養15d后，開始生根，20d后生根率達100%，至此獲得帶根無菌苗600株。至此無菌苗增殖率達到60倍。4、將600株帶根無菌苗的培養瓶瓶蓋打開，然后移入適合該樹種生長環境的輕基質容器中繼續培育，輕基質是由土壤、河沙和有機肥以2 1 2的比例混合而成，并用 0. 4 %的高錳酸鉀消毒，培育10-15天后將苗木與基質一起移栽并密植到所適應的土壤中繼續培育。幼苗成活率達到99%，獲得種苗594株。實施例二1、選取20株茁壯的色木槭一年生扦插苗。于2010年1月份休眠期放入溫室培養。2010年9月16日，剪取當年生帶腋芽莖段，去除葉片，保留Icm葉柄，以腋芽為外植體， 每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，清洗后放入質量濃度為3%的H202 中浸泡15 20分鐘，取出立即轉入含質量濃度為1 5%吐溫-80的0. HgCI2溶液中浸泡10 20分鐘，然后取出用無菌水沖洗5 6次并用滅菌吸水紙將水吸干。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0. 5cm,以去除受傷部分。接入誘導培養基WPM+6-BA1. Omg/ L+IBAO. 01mg/L+PVP500mg/L+GA3l. Omg/L PH6. 0 中。每瓶接 3 株，共接入 60 瓶。在溫度 M°C，光照時間16h/d，光強20001x的條件下，進行培養。2、外植體接入培養基6d后，外植體開始有腋芽萌動。至20d時，萌發率達97%， 共獲得175株不帶根的初代無菌苗。無菌苗株高約km，每株莖上帶有已萌動的腋芽2至4 個。將葉片去除，主干切為帶腋芽莖段，每段帶一個腋芽，共取400段。接入繼代增殖培養基WPM+6-BA0. 3mg/L+IBA0. 05mg/L+PVP500mg/L PH6. 0 中，培養條件同上。培養 IOd后，腋芽開始陸續出梢，15d后枝條開始硬化，腋芽開始飽滿，30d后，400個腋芽的萌發率達到99%，增殖率達到3. 6倍，即每株繼代苗上平均含有3. 6個腋芽，共得到腋芽1425個。3將經過繼代的無菌苗切成帶2-3個腋芽的小段，接入生根壯苗培養基 l/2MS+IBA3.0mg/LPH6.0，共接入1410株，培養條件同上。培養15d后，開始生根，20d后生根率達100%，至此獲得帶根無菌苗1410株。經過上述培養，無菌苗增殖率達到70. 5倍。5、將1410株帶根無菌苗的培養瓶瓶蓋打開，放置于室溫、通風條件良好的環境下培養5d，然后移入適合該樹種生長環境的輕基質容器中繼續培育，輕基質是由土壤、河沙和有機肥以2 1 2的比例混合而成，并用0.4%的高錳酸鉀消毒，培育10-15天后將苗木與基質一起移栽并密植到所適應的土壤中繼續培育。幼苗成活率達到98%，獲得種苗1382 株。
權利要求
1.色木槭腋芽途徑組織培養繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟A)外植體消毒9月中上旬選取色木槭一年生扦插苗的當年生帶腋芽莖段作為外植體，進行消毒處理；B)芽的分化誘導取消毒后的外植體切割為1.0-1.5cm長的莖段，其中每個莖段帶一個腋芽，將蓬段接種于誘導培養 WPM+6-BA1. 0mg/L+IBA0. 01mg/L+PVP500mg/L+GA3l. Omg/L, PH6.0中進行芽的分化誘導，控制培養溫度在25°C，光照培養20d，所述光照培養為光照時間 10_16h/d，光照強度為 1600-20001x ；C)繼代培養與增殖將步驟B)中所得色木槭嫩梢切割后接入繼代培養基 WPM+6-BA0. 3mg/L+IBA0. 05mg/L+PVP500mg/L, PH6. 0 中進行繼代培養 30d，培養溫度 25°C， 光照時間10-16h/d，光照強度為1600-20001x ；D)根的誘導將步驟C)所得色木槭試管苗接入生根培養基1/2MS+IBA3.Omg/L, PH6. 0 中進行生根培養15-20d，培養溫度20-26°C，光照時間10_16h/d，光照強度為1600-20001x。Ε)無菌苗馴化及繼續培養將步驟D)所得色木槭生根無菌苗在打開瓶蓋的環境下培養3-5d，然后移入適合該樹種生長環境的輕基質容器中繼續培育，輕基質是由土壤、河沙和有機肥以2 1 2的比例混合而成，并用0.4%的高錳酸鉀消毒，培育10-15天后將苗木與基質一起移栽并密植到所適應的土壤中繼續培育。
2.根據權利要求1或2所述的色木槭腋芽途徑組織培養繁殖方法，其特征在于，步驟 A)中的外植體消毒過程為清洗后放入質量濃度為3%的H202中浸泡15 20分鐘，取出立即轉入含質量濃度為1 5%吐溫-80的0. 1% HgCI2溶液中浸泡10 20分鐘，然后取出用無菌水沖洗5 6次并用滅菌吸水紙將水吸干。
全文摘要
本發明提供了色木槭(Acer mono Maxim)腋芽途徑組織培養繁殖方法，包括以下步驟首先進行外植體消毒，消毒后接種于誘導培養基中進行芽的分化誘導，控制培養溫度在25℃，光照時間10-16h/d、光照強度為1600-20001x下進行正常培養20d，接著將所得色木槭嫩梢切割后接入繼代培養基中進行繼代培養30d，最后將色木槭無菌苗接入生根培養基中進行生根培養15-20d，培養溫度20-26℃，光照時間10-16h/d，光照強度為1600-2000Ix。獲得生根無菌苗后，移至苗床馴化培養。通過該方法能夠有效的解決色木槭快速推廣的問題。
文檔編號A01H4/00GK102511399SQ20121000974
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者楊虹, 沈秋菊, 王宜森 申請人:南京金埔園林股份有限公司