專利名稱：一種抑制煙草愈傷組織繼代培養中褐化的方法
技術領域：
本發明涉及植物細胞工程技術領域，更具體涉及一種抑制煙草愈傷組織繼代培養中褐化的方法。適用于煙草等茄科植物愈傷組織繼代培養中褐化現象的抑制。
背景技術：
煙草是茄科煙草屬的一年生草本植物，本屬約有60種。原產于美洲和大洋洲，中國栽培4種煙草、黃花煙草、光煙草和花煙草，其中煙草種植面積最大。煙草具有藥用、工業用、保腱美容等價值，其中卷煙是煙草的主要產品，從煙葉中提取的蛋白質其營養價值高于任何奶類的蛋白質，而煙堿有殺菌止血的功能，是醫院必備的藥品。在中國煙葉和卷煙的銷量很大，是國家的高積累、高稅率商品，在國民經濟中占有重要的地位。此外，煙草作為植物組織培養的“模式植物”之一，在植物細胞工程的研究中占有重要地位。有關煙草組織和細胞培養有不少研究和報道。褐變這一在許多木本植物組培中常見的現象，也是煙草組織培養的一大障礙。褐變是指外植體在培養過程中，自身組織從表面培養基釋放褐色物質，以致培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。為了提高組織培養的成功率及維持愈傷組織較高的新陳代謝活性，必須對褐變現象加以嚴格控制。目前，國內外針對煙草組織培養過程中褐變現象的發生及引起褐變的因素有一定研究和報道。煙草細胞繼代培養過程中的褐化誘因可歸結為兩大因素1.材料的遺傳基礎及生長發育等內在因子；2.培養方式及條件等外部因子。盡管引起煙草愈傷組織繼代培養中褐變的因素很多，但如下這一點是清楚的選擇適宜的培養基，再配合使用一些抗氧化劑，調節外源激素的種類與含量，在適宜的溫度及黑暗中培養，方能使愈傷組織處于旺盛生長狀態，且能夠有效地控制褐變。我們研究發現，固體培養基的凝固情況對愈傷材料生長的影響較大。如果培養基偏軟，植物愈傷材料會因沉入培養基中造成缺氧，胞內多酚氧化酶被激活，細胞里的酚類物質氧化成棕褐色的醌類物質，這種致死性的褐化物向外擴散致使培養基逐漸變成褐色，最終愈傷組織生長不好，直至死亡。如果培養基偏硬，則植物材料吸收水分和養分困難，同樣生長不好。培養基的凝固狀況(體現為軟硬度)與瓊脂用量和培養基的PH值有關。在實際操作過程中，培養基的pH值都是在滅菌前調至預定值的，但高溫滅菌后由于培養基營養成分發生化學變化，會導致培養基的PH值也隨之改變，這是造成高溫滅菌后固體培養基凝固不好、甚至不凝固的主要原因之一。調高培養基PH值或增加瓊脂用量均可改善培養基的凝固效果。因此在配制培養基時瓊脂的用量、培養基滅菌前PH值的設定以及滅菌時如何控制培養基成分的有效性及各營養成分的順序都是抑制煙草愈傷組織繼代培養褐化的關鍵。另外，向培養基中加入適量吸附劑聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，以吸收愈傷組織生長過程中產生的有毒物質也是抑制煙草愈傷組織繼代過程中褐化的一個新思路。

發明內容
本發明的目的在于提供一種抑制煙草愈傷組織繼代培養過程中褐化的方法。方法簡單易行，操作方便，有效抑制了煙草愈傷組織繼代過程中的褐變，效果好，煙草愈傷組織增殖率可達11.29(倍)；另外，該發明為煙草愈傷組織懸浮培養提供了優良的細胞種源。該方法培養的煙草愈傷組織松軟，為獲得分散均勻的懸浮細胞系提供了良好的條件。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術措施一種抑制煙草愈傷組織繼代培養過程中褐化的方法，其步驟是A :配制KCMS培養基。培養基的成分組成及工作濃度如下大量元素為硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀(KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、 七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅 (CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化鈷(COCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵 (FeSO4 ·7Η20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA ·2Η20) 37. 3mg/L ;肌醇 O. 5mg/ L ;維生素B1L 3mg/L ;2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 2mg/L、激動素(KT)O. lmg/L ;聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)O. 5g/L ;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L ;瓊脂8_10g/L ;蔗糖30g/L。滅菌前將培養基PH調節至5. 6-6。B =KCMS培養基滅菌將A步驟中所述KCMS培養基成分分成三部分獨立滅菌。 三部分分別為鐵鹽(七水合硫酸鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉 (Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L)、微量元素(碘化鉀(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、 四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 · 6H20)O. 025mg/L)和KCMS培養基其他營養成分(大量元素、肌醇、維生素B1^, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動素(KT)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、 瓊脂和蔗糖)。以上三部分KCMS培養基營養成分分別進行濕熱滅菌。鐵鹽部分滅菌條件為121. 30C 30min，微量元素部分滅菌條件為121. 3°C 30min, KCMS培養基其他營養成分部分滅菌條件為121. 30C 20min。滅菌完成后待以上三部分KCMS培養基營養成分均冷卻至 50-60°C，在無菌操作臺上將它們混合均勻，并分裝至IOOmL錐形瓶(錐形瓶提前121. 3°C滅菌30min)，每瓶分裝20mL KCMS培養基。C :待B步驟中IOOmL三角瓶內KCMS培養基自然冷卻至室溫(20_25°C，以下相同) 并黑暗水平擱置2-3天后，可將煙草愈傷組織轉移到凝固好的KCMS培養基表面，放置在光照培養箱中培養。培養條件為22-26h黑暗，培養箱溫度24-26°C，培養箱濕度18% ~20%o 20-24天繼代一次。此方法下培養的煙草愈傷組織生長分裂旺盛，增殖率可達11. 29 (倍)。 全過程中培養基始終維持亮黃色，表明煙草愈傷組織向培養基中分泌的有毒褐化物質少， 褐化現象得到明顯的抑制；此外，新分裂形成的煙草愈傷組織為乳白色且松軟，利于進行下一代轉接。本發明具有如下的優點和效果I.有關本發明的效果請見下表材料顏色材料狀態材料褐化懸浮培養增殖率 (增重倍數)培養基狀態本方法乳白- 淺黃松軟輕，繼代 26天出現褐化懸浮細胞分散均勻，顆粒細小11.29亮黃色，彈性適中常規方法黃-白緊實重，繼代 10-12天出現褐化懸浮細胞成團5.64白色，較堅硬2.本發明無需增加專用設備，操作方便，有效抑制了煙草愈傷組織繼代過程中的褐化，則大大保證了煙草愈傷組織培養的成功率；同時該方法也促進了煙草愈傷組織的快速生長。3.本發明中獲得的煙草愈傷組織松軟，可為液體懸浮培養模式提供優良的細胞種源。主要體現在本方法下獲得的煙草愈傷組織經過液體懸浮培養時能分散均勻，不黏粘成團；并且僅5-8個煙草細胞構成I個顆粒，故顆粒細小。這樣不僅保證了煙草細胞與培養基中營養成分的有效接觸，也保證了煙草細胞生長的同步性。因此，無論是作為科研材料還是用于工廠化大規模培養以提取煙堿等的煙草細胞種源，都是最佳選擇。
具體實施例方式實施例I :下面對本發明的實施例作進一步詳細描述一種抑制煙草愈傷組織繼代過程中褐化的方法，它采用如下步驟步驟一以煙草種子播種后萌發出的子葉為外植體，用體積比為75%的酒精浸泡 20或24或26或28或30s后，再用質量體積比為O. I %的氯化汞消毒6或7分鐘，用無菌水沖洗8或9或10次。步驟二 配制MS固體培養基(大量元素硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀 (KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/ L、磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、 四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L ;有機物質肌醇O. lg/L、煙酸O. 5mg/L、維生素 B6O. 5mg/L、維生素B1O. lmg/L、甘氨酸2. Omg/L ;鹿糖30g/L ;瓊脂7g/L)。將MS培養基濕熱滅菌(121. 3°C，滅菌20min)并冷卻至室溫后，將步驟一中消毒好的煙草種子轉移到MS培養基中培養。步驟三此過程在無菌條件下完成取步驟二中生長20d后的煙草子葉切成Imm 左右，在以下培養基中誘導煙草愈傷組織大量元素硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀 (KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/ L、磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、
5四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L ;有機物質肌醇O. lg/L、煙酸O. 5mg/L、維生素 B6O. 5mg/L、維生素 B1O. lmg/L、甘氨酸 2. Omg/L ;激素:2,4-二氯苯氧乙酸(2,4_D)0. 5mg/L、 激動素(KT)0.05mg/L ;葡萄糖2% (質量體積比)；瓊脂7g/L。本步驟中培養基pH值調節到5. 6，培養條件為25 °C，14小時光照，光強40 μ E · m_2 · s'步驟四配制KCMS培養基。培養基的成分組成及工作濃度如下大量元素 硝酸銨(NH4NO3) I. 65g/L、硝酸鉀(KNO3) I. 9g/L、二水合氯化鈣(CaCl2 · 2H20) O. 44g/L、 七水合硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 37g/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) O. 17g/L ;微量元素碘化鉀(KI) O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L、四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅 (CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化鈷(CoCl2 · 6H20) O. 025mg/L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵 (FeSO4 ·7Η20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA ·2Η20) 37. 3mg/L ;肌醇 O. 5mg/ L ;維生素B1L 3mg/L ;2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 2mg/L、激動素(KT)O. lmg/L ;聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)O. 5g/L ;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L ;瓊脂8_10g/L ;蔗糖30g/L。滅菌前將培養基pH調節至5.8。步驟五KCMS培養基滅菌。將步驟四中所述KCMS培養基成分分成三部分獨立滅菌。三部分分別為鐵鹽(七水合硫酸鐵(FeSO4 · 7H20) 27. 8mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA · 2H20) 37. 3mg/L)、微量元素(碘化鉀(KI)O. 83mg/L、硼酸(H3BO3) 6. 2mg/ L、四水合硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 22. 3mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 8. 6mg/L、二水合錳酸鈉(Na2MnO4 · 2H20) O. 25mg/L、五水合硫酸銅(CuSO4 · 5H20) O. 025mg/L、六水合氯化鈷 (CoCl2 ·6Η20)0. 025mg/L)和KCMS培養基其他營養成分(大量元素、肌醇、維生素&、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動素(KT)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、瓊脂和蔗糖-各成分工作濃度請見步驟四)。以上三部分KCMS培養基營養成分分別進行濕熱滅菌。鐵鹽部分滅菌條件為121. 3 °C 30min，微量元素部分滅菌條件為121. 3 °C 30min，KCMS培養基其他營養成分部分滅菌條件為121. 30C 20min。滅菌完成待以上三部分KCMS培養基營養成分均冷卻至50或52或54或56或58或60°C后在無菌操作臺上將它們混合均勻，并分裝至IOOmL三角瓶，每瓶分裝20mL KCMS培養基。步驟六待步驟五中IOOmL三角瓶內KCMS培養基自然冷卻至室溫并黑暗水平擱置 2或4天后，將步驟三中誘導形成的煙草愈傷組織轉移到凝固好的KCMS培養基表面，放置在光照培養箱中培養。培養條件為24h黑暗，培養箱溫度25°C，培養箱濕度18% -20%, 20 或21或22或23或24天繼代一次。實驗例經實驗證實，常規方法誘導出的煙草愈傷組織增殖過程中的褐化率為52. 4%，本方法中的煙草愈傷組織的褐變率為12. 1%。
權利要求
1 .一種抑制煙草愈傷組織繼代培養過程中褐化的方法，其步驟是A :配制KCMS培養基培養基的成分組成及工作濃度如下大量元素為硝酸銨I. 65g/ L、硝酸鉀I. 9 g/L、二水合氯化鈣O. 44 g/L、七水合硫酸鎂O. 37 g/L、磷酸二氫鉀0.17 g/ L ;微量元素碘化鉀O. 83 mg/L、硼酸6. 2 mg/L、四水合硫酸錳22. 3 mg/L、七水合硫酸鋅 8.6 mg/L、二水合錳酸鈉O. 25 mg/L、五水合硫酸銅O. 025 mg/L、六水合氯化鈷O. 025 mg/ L ;鐵鹽七水合硫酸亞鐵27. 8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉37. 3 mg/L ;肌醇O. 5 mg/L ； 維生素B1 I. 3 mg/L ;激素2，4-二氯苯氧乙酸O. 2mg/L、激動素O. I mg/L ;聚乙烯基卩比咯燒酮O. 5g/L ;磷酸二氫鉀200 mg/L ;瓊脂8_10g/L ;蔗糖30g/L ;滅菌前將培養基pH值調節至5.6~6 ；B =KCMS培養基滅菌將A步驟中所述KCMS培養基成分分成三部分滅菌，三部分分別為鐵鹽七水合硫酸鐵27. 8 mg/L、二水合乙二胺四乙酸二鈉37. 3 mg/L ;微量元素碘化鉀O.83 mg/L、硼酸6. 2 mg/L、四水合硫酸錳22. 3 mg/L、七水合硫酸鋅8. 6 mg/L、二水合錳酸鈉O. 25 mg/L、五水合硫酸銅O. 025 mg/L、六水合氯化鈷O. 025 mg/L和KCMS培養基其他營養成分大量元素、肌醇、維生素氏、2，4-二氯苯氧乙酸、激動素、聚乙烯基吡咯烷酮、磷酸二氫鉀、瓊脂和蔗糖，以上三部分KCMS培養基營養成分分別進行濕熱滅菌，鐵鹽部分滅菌條件為121. 30C 30min，微量元素部分滅菌條件為121. 3°C 30min, KCMS培養基其他營養成分部分滅菌條件為121. 3°C 20min，滅菌完成后以上三部分KCMS培養基營養成分均冷卻至 50-60°C，在無菌操作臺上混合均勻，并分裝至100 mL三角瓶，每瓶分裝20 mL KCMS培養C :待B步驟中100 mL三角瓶內KCMS培養基自然冷卻至室溫，并黑暗水平擱置2_3天后，將煙草愈傷組織轉移到凝固好的KCMS培養基表面,放置在光照培養箱中培養,培養條件為22-26h黑暗，培養箱溫度24-26°C，培養箱濕度18%_20%，20-24天繼代一次。
全文摘要
本發明公開了一種抑制煙草愈傷組織繼代過程中褐化的方法，其步驟A、選取煙草種子萌發出的子葉為組織培養的外植體；B、通過平衡滅菌前培養基pH值和瓊脂含量使培養基達到適合愈傷組織生長的最佳凝固效果；C、鐵鹽與微量元素分開滅菌；D、在培養基中加入0.5g/LPVP，并使培養箱濕度控制在18%-20%。該方法簡單易行，操作方便，有效抑制了煙草愈傷組織繼代過程中的褐變，效果好，煙草愈傷組織增殖系數可達到11.29(倍)；另外，該發明為煙草愈傷組織懸浮培養提供了優良的細胞種源。該方法培養的煙草愈傷組織松軟，為獲得分散均勻的懸浮細胞系提供了良好的條件。
文檔編號A01H4/00GK102577953SQ20121003096
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月13日 優先權日2012年2月13日
發明者劉永定, 尹黎燕, 畢永紅, 胡征宇, 黃文敏 申請人:中國科學院水生生物研究所