專利名稱：防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養方法，尤其是一種防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法。
背景技術：
黃藤為防己科天仙藤屬植物天仙藤(Fibraurea recisa Pierre)的藤莖,別名藤黃連、土黃連，收載于2005年版的《中華人民共和國藥典》中。黃藤主要分布在我 國的廣西和云南等地，此外在越南、緬甸等國也有分布。黃藤不但具有清熱解毒、利尿的功效，而且還有預防流腦和降血壓等作用，主治婦科炎癥、外科感染、菌痢、腸炎、呼吸道感染及眼結膜炎等癥，是黃藤素栓、黃藤素注射劑、黃藤素和黃藤素片等中成藥的主要原料。隨著新藥黃藤素栓等的開發，黃藤資源需求量日益增加，導致野生資源遭到毀滅性破壞。由于資源短缺，黃藤收購量逐年下降，部分制藥企業被迫停止生產。因此，開展黃藤人工栽培已成當務之急，首先必須先解決種苗供應問題。目前，國內外研究黃藤主要集中在化學成分和藥理方面，而對其種苗繁育技術報道甚少。由于黃藤種子具有二次結實的特性，采集時間性要求很強，因而收集種子困難，用種子繁殖難以滿足生產需要。雖然也有扦插繁殖的研究報道，但效果不很理想，生根時間較長，且生根成活率較低，這在一定程度上限制了該樹種在我國的發展。組織培養是唯一不受季節等外在因素限制可快速繁殖種苗的方法，然而，褐化污染等原因會嚴重影響黃藤組培苗的生長發育，亟待解決。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法，以解決黃藤種苗繁育難的現狀，實現黃藤的快速繁育，為生產提供大量優質種苗。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法，包括以下步驟〈1>將5 6月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存2 3d ;<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上；〈3>步驟〈2>接種的莖段先進行暗培養，暗培養3d后轉為光培養，一周后轉入液體培養基；液體培養基培養I 3d后再轉入固體培養基，固體培養基培養I 3d后再轉入液體培養基，依法每I 3d進行液、固體培養基轉瓶一次，持續時間27 30d。初代培養基或固體培養基以MS培養基為基礎，含有下列濃度的物質BA 2. Omg.L'NAA O. lmg. L—1、100mg/L Vc、0. 7%瓊脂、3%鹿糖；液體培養基以MS培養基為基礎，含有下列濃度的物質BA 2. Omg. L'NAA O. lmg.L'lOOmg/L Vc、3%鹿糖。 酒精為體積濃度70 %的乙醇水溶液，升汞為質量濃度0. I %的氯化汞水溶液。
在黃藤組織培養中防褐化研究中，發明人建立了本發明的防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法，通過對新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段進行接種前冷藏保存處理，保證了黃藤莖段的誘導率且降低其污染率及褐化率；通過酒精和升汞消毒滅菌，降低了初代培養的污染率及褐化率并保證其誘導率；利用組織培養中后期組合培養并不斷進行轉瓶處理(即先暗培養再轉入光培養的方式并采用固液交替培養方式，轉瓶周期不超過3d)從而有效防止甚至消除黃藤褐化，降低了褐化率并在一定程度上提高其誘導率，促進植物的生長，保證了黃藤種苗的快速繁育，從而有效地保障黃藤種苗的供應。
具體實施例方式以下實施例和對照例所用試劑材料如下初代培養基或固體培養基MS+BA (6-芐氨基腺嘌呤)2. Omg. L^+NAA (奈乙酸)
O.lmg. L_1+100mg/L Vc (抗壞血酸)+0. 7% 瓊脂 +3% 鹿糖。
液體培養基MS+BA2. Omg. L :+NAA O. lmg. L ^lOOmg/L Vc+3%鹿糖。酒精體積濃度70 %的乙醇水溶液。升汞質量濃度O. I %的氯化汞水溶液。實施例I (3天轉瓶)<1>將5月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存3d ；<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上；<3>步驟〈2>接種的莖段先進行暗培養，暗培養3d后轉為光培養，一周后轉入液體培養基；液體培養基培養3d后再轉入固體培養基，固體培養基培養3d后再轉入液體培養基，依法每3d進行液、固體培養基轉瓶一次，持續時間為27d。實施例2 (2天轉瓶)〈1>將6月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存2d ；<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上；<3>步驟〈2>接種的莖段先進行暗培養，暗培養3d后轉為光培養，一周后轉入液體培養基；液體培養基培養2d后再轉入固體培養基，固體培養基培養2d后再轉入液體培養基，依法每2d進行液、固體培養基轉瓶一次，持續時間為28d。實施例3 (7天轉瓶)〈1>將5月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存3d ；<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上；<3>步驟〈2>接種的莖段先進行暗培養，暗培養3d后轉為光培養，一周后轉入液體培養基；液體培養基培養7d后再轉入固體培養基，固體培養基培養7d后再轉入液體培養基，依法每7d進行液、固體培養基轉瓶一次，持續時間為28d。對照例I (多次轉移法)<1>將5月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存3d ；<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上；<3>步驟〈2>接種的莖段先進行暗培養，暗培養3d后轉為光培養，一周后轉入同樣的固體培養基內；新的固體培養基培養3d后再轉入相同的固體培養基，依法每3d進行固體培養基轉瓶一次，持續27d。對照例2 (光暗培養法)〈1>將5月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存3d ；<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上；<3>步驟〈2>接種的莖段先進行光培養，光培養3d后轉為暗培養，培養基不改變，不進行轉瓶，3d后再轉入光培養環境,依法每3d進行光、暗培養轉換一次,持續27d。 對照例3 (紙橋培養法)〈1>將5月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存3d ；<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后用酒杯狀的濾紙代替瓊脂，使杯底朝上塞入試管中，將外植體置于濾紙上方接種到液體培養基上進行培養，不再進行更換培養基。對照例4 (單獨培養法)〈1>將5月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存3d ；<2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上，不再進行轉瓶，一個月后觀察結果。以上實施例及對照例每組處理30株，經過約I個月培養，觀察記錄黃藤植株誘導率及褐化率，結果如表I。表I不同后培養方式對黃藤褐化率及生長的影響。
權利要求
1.一種防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法，其特征在于包括以下步驟 <1>將5 6月收集的新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段在冰箱冷藏保存2 3d ; 〈2>步驟〈1>處理后的帶頂芽莖段先用酒精消毒，再用升汞處理lOmin，然后接種到初代培養基上； <3>步驟〈2>接種的莖段先進行暗培養，暗培養3d后轉為光培養，一周后轉入液體培養基；液體培養基培養I 3d后再轉入固體培養基，固體培養基培養I 3d后再轉入液體培養基，依法每I 3d進行液、固體培養基轉瓶一次，持續時間27 30d。
2.根據權利要求I所述的防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法，其特征在于 所述初代培養基或固體培養基以MS培養基為基礎，含有下列濃度的物質BA 2. Omg.L'NAA O. lmg. L—1、100mg/L Vc、0. 7%瓊脂、3%鹿糖； 所述液體培養基以MS培養基為基礎，含有下列濃度的物質BA 2. Omg. L'NAA O. lmg.L'lOOmg/L Vc、3%鹿糖。
3.根據權利要求2所述的防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法，其特征在于所述酒精為體積濃度70%的乙醇水溶液，所述升汞為質量濃度O. 1%的氯化汞水溶液。
全文摘要
本發明公開了一種防止黃藤愈傷組織褐化現象產生的方法，通過對新鮮黃藤幼嫩帶頂芽莖段進行接種前冷藏保存處理、酒精和升汞消毒滅菌，利用組織培養中后期組合培養并不斷進行轉瓶處理從而有效防止甚至消除黃藤褐化，降低了褐化率并在一定程度上提高其誘導率，促進植物的生長，保證了黃藤種苗的快速繁育，從而有效地保障黃藤種苗的供應，為黃藤產業化發展提供支持。
文檔編號A01H4/00GK102805032SQ201210295550
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者閆志剛, 胡東南, 馮世鑫, 徐永莉, 栗東霞 申請人:廣西壯族自治區藥用植物園