專利名稱：一種抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的制備方法、產品及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的制備方法、產品及其應用，屬于新材料領域。
背景技術：
由表面活性劑包裹的多酸鹽組裝構筑有序結構成為近年來的研究熱點。多酸鹽(polyoxometalates,簡寫POMs)是一類新型的納米級無機大分子，能很好地溶解在水中，以巨大陰離子的形式存在。基于靜電相互作用，帶相反電荷的表面活性劑可以對多酸鹽進行表面修飾。最新研究發現，表面活性劑包覆的多酸鹽復合物(surfactant-encapsulatedpolyoxometalates, SEPs)可以在固體基底上形成規則有序的多孔薄膜。 可用來構筑有序多孔薄膜的體系有很多，如應用聚合物、嵌段共聚物、兩親型聚離子復合體、表面活性劑修飾的多酸鹽以及金屬納米顆粒等。其中，對表面活性劑修飾的多酸鹽混合體系構筑多孔有序薄膜的研究一直比較活躍，這主要與表面活性劑本身所具有的兩親性及其殺菌等性能方面的優勢有關。表面活性離子與帶相反電荷的多酸鹽離子通過靜電相互作用形成大的聚集體，在合適的條件下構筑規整有序的多孔膜結構。可以通過采用不同表面活性劑、調節表面活性劑的濃度、改變在成膜過程中所需的濕度等來調節形成多孔薄膜的孔徑，從而滿足不同應用的要求。

發明內容
本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種制備抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法。在該體系中，通過對表面活性劑種類、濃度、基底種類、通入氣體得溫度濕度等來調節多孔有序薄膜的孔徑大小，方便地進行調節制備孔徑多尺度的規則有序薄膜材料，從而滿足在各種情形下的實際應用。為實現上述目的，本發明采用下述技術方案一種制備抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法，其特征是，其步驟包括(I)稱取以Br—或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑，備用；(2)以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液的制備配制濃度為0. 06 0. 08克/升，以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液，使多酸鹽充分溶解，待用；(3)以表面活性劑修飾的多酸鹽復合物溶液的制備利用靜電相互作用，將步驟I配制的以Br—或 Cr為反離子的陽離子表面活性劑加入到步驟(2)中配制好的以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液，以Br—或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑與以Na+為反離子的陰離子多酸鹽物質的量之比為9 1-13 I。攪拌，使之充分混合；(4)以表面活性劑修飾的多酸鹽復合物的制備
將步驟(3)中的混合物過濾，棄上清，洗滌沉淀，干燥，得表面活性劑修飾的多酸鹽復合物；(5)多酸鹽復合物的氯仿溶液的制備將步驟(4)中得到的復合物溶于氯仿，配制成濃度為I. O 2.0克/升的一系列溶液；優選I. 4-1. 6克/升。(6)蜂窩狀多孔有序薄膜的制備將步驟(5)制備的溶液滴加到固體基底上，通入潮濕的氣流，待溶劑完全揮發，得 到蜂窩狀多孔有序薄膜。上述步驟(I)中所述以Br—或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑具體選自雙十六烷基二甲基溴化銨(DHABr)或雙十八烷基二甲基氯化銨(D0DMAC1)。上述步驟(2)中所述以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液具體選自多酸鹽Na11 [Coff11O39]。I.該多孔膜抑制細菌生長的作用按照步驟(6)所述的制備方案，構筑多孔有序薄膜。加入細菌懸浮液，培養一定時間，取出細菌懸浮液，稀釋，顯微鏡直接計數和平板菌落計數法進行細菌計數。2.該多孔有序薄膜抗乙肝病毒的功能按照步驟(6)所述的制備方案，構筑多孔有序薄膜。加入乙肝病人的血清，在37°C培養箱中培養一定時間，運用實時PCR熒光定量核酸擴增進行檢測。3.該多孔有序薄膜無細胞毒性的研究按照步驟(6)所述的制備方案，構筑多孔有序薄膜。加入正常細胞懸浮液，在37°C培養箱中培養一定時間，計細胞個數，將其與空白樣品進行比較。4.該多孔有序薄膜無溶血性能的研究按照步驟(6)所述的制備方案，在細胞培養板上形成多孔有序薄膜。將正常健康人的血液加入向膜和膜的浸提液中，在37 °C培養箱中培養一定時間，顯微鏡下觀察紅細胞的形貌。將其與空白樣品、陽性對照進行比較。步驟￠)中所述制備過程中，交換裝置自行制備，見附圖I。在氣體流量計的控制下，使氮氣流通過盛有水的集氣瓶，在固體基底上方形成穩定的潮濕氣流。本發明描述了一種制備抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法，該方法的技術要點有以下三個方面1)首先，以Br—或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑本身具有良好的疏水性，其可以控制陽離子表面活性劑與多酸鹽的摩爾比例來制備復合物；2)其次，多孔有序薄膜的孔徑可通過調節表面活性劑的濃度、改變在成膜過程中所需的濕度等方便的進行控制；3)在進行生物醫學功能測試時，注意避免雜菌污染，操作準確快速。本發明的突出特色是1)運用將表面活性劑修飾的多酸鹽復合材料成功構筑蜂窩狀多孔有序薄膜，這樣得到的多孔薄膜保持了表面活性劑殺菌等方面特性，從而能夠滿足特定條件下的使用要求；2)體系中陽離子表面活性劑的種類、濃度等可以方便的調控多孔有序膜的孔徑大小，從而提高了體系適應不同應用的要求，拓寬了在生物醫學方面的應用范圍；3)多孔有序薄膜在制備完成后具有很好的穩定性，能夠在室溫下長期放置而不會發生形貌變化，無菌條件下保存即可滿足后期生物醫學應用。本發明還提供了采用上述的制備抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法制備的生物兼容薄膜。本發明的優勢在于，制備得到的構筑蜂窩狀多孔有序薄膜保持了表面活性劑殺菌等方面特性；可以通過調節體系中陽離子表面活性劑的種類、濃度等方便的調控多孔有序膜的孔徑大小；多孔有序薄膜在制備完成后具有很好的穩定性，能夠在室溫下長期放置而不會發生形貌變化，從而提高了體系適應不同應用的要求，拓寬了在生物醫學方面的應用范圍。本發明中構筑蜂窩狀有序多孔薄膜所采用的物質為多金屬氧酸鹽Na11 [Coff11O39]和雙鏈陽離子表面活性劑，多酸鹽和表面活性劑組裝所需的驅動力是陰陽離子之間的靜電吸引作用。將組裝得到的復合物溶液滴加至固體基底，在潮濕氣流的作用下，利用水滴模板的方法構筑規則有序的蜂窩狀多孔薄膜。研究了蜂窩狀多孔有序薄膜對于多種細菌的抑制 作用，抗乙肝病毒功能。該多孔薄膜能夠顯著的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等生長；抑制乙肝病毒核酸擴增。因此本發明另外提供了上述的生物兼容薄膜在制備細菌抑制劑中的應用。上述應用特別是其在制備抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌的細菌抑制劑中的應用。本發明還提供了上述的生物兼容薄膜在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。為了拓寬實際應用范圍，我們進行了細胞毒性以及溶血方面的測試，發現該多孔薄膜對正常細胞無毒性，無溶血性能，這打消了應用方面上很大的顧慮，有望應用于臨床治療。本發明中制備的蜂窩狀多孔膜具有很多特性和重大的潛在應用，該多孔有序薄膜在除菌過濾、細菌傳感器的制備等方面具有重要的應用價值，有望在工業污水處理、負載敷藥、血液濾膜及治療肝病等方面實現應用。


圖I制備蜂窩狀多孔有序薄膜的實驗裝置示意圖。圖2實施例I中多孔有序薄膜透射電子顯微鏡照片(兩幅圖是不同倍數下透射電鏡照片)。圖3實施例I中多孔有序薄膜掃描電子顯微鏡照片。圖4實施例2中多孔有序薄膜掃描電子顯微鏡照片。圖5實施例3中多孔有序薄膜原子力顯微鏡照片。圖6實施例3中多孔有序薄膜掃描電子顯微鏡照片。圖7實施例4中a-f各樣品中的抑菌環照片。其中a-f樣品依次為ICoW11O3J n_(a)，(Coff11O39I (DHA) n (b), (Coff11O39I (DODMA)11(C), CHCl3 (d)，DHABr (e)，D0DMAC1 (f)，各樣品中的水溶液里，以上測試物質濃度均為2g/L。圖8實施例5分別培養3h、6h、10h后顯微鏡直接計數法進行細菌計數的結果。各個樣品培養溫度環境均相同。圖9和圖10為實施例6和例7，分別為加入銅綠假單胞菌懸浮液和金黃色葡萄球菌，培養lh、3h、5h，平板菌落計數法進行細菌計數結果。各個樣品培養溫度環境均相同。
圖11實施例8分別向多孔膜和膜的浸提液分別加入正常健康人的血液，在37°C培養箱中培養，顯微鏡下觀察細胞形態變化。各個樣品培養溫度環境均相同。測試蜂窩狀多孔膜的溶血率，和浸提液的溶血率。
圖12為實施例9細胞毒性實驗測試。各個樣品培養溫度環境均相同。
具體實施例方式下面通過具體實例對本發明進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。實施例I :制備抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法，包括如下步驟(I)稱取9. 2毫克的雙十六烷基二甲基溴化銨(DHABr)，備用；(2)多酸鹽Na11 [CoW11O39]水溶液的制備稱取3. 8毫克多酸鹽Na11 [CoW11O39]，充分溶解在50毫升蒸餾水中，配制濃度為
O.076克/升的多酸鹽Na11 [Coff11O39]水溶液，待用；(3)以表面活性劑修飾的多酸鹽復合物溶液的制備利用靜電相互作用，將步驟I稱取的雙十六烷基二甲基溴化銨(DHABr)加入到步驟2中配制好的以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液50毫升中，攪拌，使之充分混合；得表面活性劑復合物。(陽離子表面活性劑DHABr與以Na+為反離子的陰離子多酸鹽物質的量之比為12. 5 I)(4)以表面活性劑修飾的多酸鹽復合物的制備將步驟(3)中的混合物過濾，棄上清，洗滌沉淀，干燥，得表面活性劑修飾的多酸鹽復合物；(5)多酸鹽復合物的氯仿溶液的制備將步驟(4)中得到的復合物溶于氯仿，配制成濃度為I. 0、1. 2、1. 4、1. 6、1. 8、2. O
克/升的一系列溶液，研究其形成蜂窩狀多孔有序薄膜的形貌；(6)蜂窩狀多孔有序薄膜的制備將步驟(5)制備的溶液滴加到固體基底上，通入潮濕的氣流，氣流速度為lL/min，待溶劑完全揮發，得到蜂窩狀多孔有序薄膜。陽離子表面活性劑為雙十六烷基二甲基溴化銨(DHABr)，在步驟(5)得到的多酸鹽復合物濃度為I. 6g/L時，制備的多孔有序薄膜其透射電子顯微鏡照片和掃描電子顯微鏡分別如圖2和圖3所示，圖2、圖3的電鏡照片中表示了我們制備了規則有序的多孔薄膜結構。實施例2 :在實施例I的基礎上，將步驟(I)雙十六烷基二甲基溴化銨(DHABr)的質量調整為7毫克(陽離子表面活性劑DHABr與以Na+為反離子的陰離子多酸鹽物質的量之比為9. 5 I);依然可以得到規整有序的多孔薄膜。在步驟(5)得到的多酸鹽復合物濃度為I. 6g/L時,其掃描電子顯微鏡如圖4所不。實施例3 :在實施例I的基礎上，將步驟(I)雙十六烷基二甲基溴化銨(DHABr)的質量調整為8. 2毫克(陽離子表面活性劑DHABr與以Na+為反離子的陰離子多酸鹽物質的量之比為11. I I);在步驟(5)得到的多酸鹽復合物濃度為1.6g/L時，依然可以得到規整有序的多孔薄膜。
實施例4 :在實施例I的基礎上，將陽離子表面活性劑調整為雙十八烷基二甲基氯化銨(D0DMAC1)，步驟(5)采用的多酸鹽復合物濃度為I. 4g/L，時，依然可以制備得到規整有序的多孔薄膜材料，制備的多孔有序薄膜其原子力顯微鏡照片和掃描電子顯微鏡分別示于圖5和圖6中。圖5、圖6表示的電鏡照片中表示了我們制備了規則有序的多孔薄膜結構。實施例5 :在實施例I、例4的基礎上，向浸入大腸桿菌懸浮液中一定時間的濾紙片上加入表面活性劑復合物SEPs的溶液，在37 °C培養箱中培養，12小時后抑菌環明顯，照片如圖7。其中由a-f樣品依次為(Coff11O39I n-(a)，(Coff11O39I (DHA) n (b)，(Coff11O39I (DODMA) n (c)，CHCl3 (d)，DHABr (e)，D0DMAC1 (f)。以形成薄膜所用的復合物(Coff11O39I (DHA) n (b)和(Coff11O39I (DODMA) n(c)為測試產品。其他物質為對照，分別是{COWn039}n_(a)，代表Na+為反離子的陰離子多酸鹽；CHCl3(d)為形成蜂窩狀多孔膜時SEPs溶液的溶劑，陽離子表面活性劑DHABr (e)和D0DMAC1 (f)表示復合物SEPs的形成原料；其中，對照組a、e、f與測試組b、c采用相同的濃度，均為2. Og/L,即a為ICoW11O3J n_2. Og/L的水溶液；e為DHABr的2. Og/L氯仿溶液；f為DODMACI的2. Og/L氯仿溶液；分別10 μ L加入到濾紙片上。這表明，多酸鹽和表面活性劑復合物SEPs在溶液狀態下就具有抑制細菌生長的作用。這為采用表面活性劑復合物SEPs構筑成蜂窩狀多孔薄膜，為進一步研究多孔薄膜抑制細菌生長提供了依據。實施例6 :如圖8所示，在實施例I、例4的基礎上，加入大腸桿菌懸浮液，37°C培養箱中分別培養3h、6h、10h，取出細菌懸浮液，稀釋，顯微鏡直接計數法進行細菌計數。由SEPs——(Coff11O39I (DHA)1^ {CoWn039} (DODMA) n在潮濕氣流的作用下，形成的蜂窩狀多孔薄膜表現出比對照材料更好的抑制大腸桿菌生長的能力。對照材料分別是陽離子表面活性劑DHABr，D0DMAC1的氯仿溶液揮發后留下的無規則結構薄膜；Na+為反離子的陰離子多酸鹽ICoW1J n_揮發后留下的無規則結構薄膜；以及空白對照(即不加任何干擾因素，正常情況下細菌生長)。各溶液的濃度一致，均為2. Og/L。實施例7 :如圖9所示，分別在不同物質形成的膜上培養銅綠假單胞菌lh、3h、5h后，得到的銅綠假單胞菌的數量；對照組分別為{CoWn039} (DHA)11和ICoW11O3J (DODMA)11在沒有通入潮濕氣流時形成的無規則結構薄膜；陽離子表面活性劑DHABr，D0DMAC1的氯仿溶液揮發后留下的無規則結構薄膜；Na+為反離子的陰離子多酸鹽ICoW1J ^揮發后留下的無規則結構薄膜；以及空白對照，各溶液的濃度一致，均為2. Og/L。在實施例I、例3的基礎上，加入銅綠假單胞菌懸浮液，37°C培養箱中分別培養lh、3h、5h，取出細菌懸浮液，稀釋，平板菌落計數法進行細菌計數。由SEPs——(Coff11O39I (DHA)11和{CoWn039} (DODMA)11在潮濕氣流的作用下，形成的蜂窩狀多孔薄膜表現出比其他材料更好的抑制銅綠假單胞菌生長的能力。值得一提的是，由SEPs形成蜂窩狀多孔薄膜的抑菌性能比沒有形成蜂窩狀多孔膜的SEPs具有更好的抑制細菌的能力。膜排列形成規則多孔結構后抗菌能力明顯增強是由于，鋪展形成多孔薄膜結構以后，表面活性劑包裹ICoW11O3iJ11-形成的復合物與細菌作用的表面積增加，從而殺菌能力增強。實施例8 :如圖10所示，分別在不同物質形成的膜上培養金黃色葡萄球菌lh、3h、5h后，得到的抑菌活性(由各物質得到的金黃色葡萄球菌數量與空白對照組得到的細菌數量之比得出)；對照組分別為{Cown039} (DHA)1JP {CoWn039} (DODMA) n在沒有通入潮濕氣流時形成的無規則結構薄膜；陽離子表面活性劑DHABr，D0DMAC1的氯仿溶液揮發后留下的無規則結構薄膜；Na+為反離子的陰離子多酸鹽ICoW1J 揮發后留下的無規則結構薄膜；以及空白對照，各溶液的濃度一致，均為2. Og/L。在實施例I、例3的基礎上，加入金黃色葡萄球菌懸浮液，37°C培養箱中分別培養lh、3h、5h，取出細菌懸浮液，稀釋，平板菌落計數法進行細菌計數。由SEPs——(Coff11O39I (DHA) n和{CoWn039} (DODMA) n在潮濕氣流的作用下，形成的蜂窩狀多孔薄膜表現出比其他材料更好的抑制金黃色葡萄球菌生長的能力。值得一提的是，由SEPs形成蜂窩狀多孔薄膜的抑菌性能比沒有形成蜂窩狀多孔膜的SEPs具有更好的抑制細菌的能力。實施例9 :如圖11所示，Hemolysis rate of films表示膜的溶血率(即圖中每組柱狀圖的左側一個)；Hemolysis rate of leach solutions表示浸出液的溶血率,其中DHABr和D0DMAC1表示陽離子表面活性劑揮發后留下的無規則結構薄膜control表示陽性對照，本專利采用的是濃鹽酸溶液；CoW_water代表Na+為反離子的陰離子多酸鹽(Coff11O39I n_揮發后留下的無規則結構薄膜；Coff-DHA和CoW-DODMAC分別表示以復合物(Coff11O39I (DHA)11和{CoWn039} (DODMA)11形成的蜂窩狀多孔膜；在實施例I、例4的基礎上，向多孔膜和膜的浸提液分別加入正常健康人的血液，在37°C培養箱中培養,顯微鏡下觀察細胞形態變化。從附圖11中，得知該多孔薄膜和膜的浸提液溶血率均在5%以后，說明該多孔膜以及膜的組成成分均沒有溶解血細胞的功能，細胞相容性好。實施例10 :如圖12所示，橫坐標分別為包括對照在內的各物質(陽離子表面活性劑DHABr，D0DMACl揮發后留下的無規則結構薄膜；以復合物{CoWn039} (DHA)11和ICoW11O3J(DODMA)11形成的蜂窩狀多孔膜；Na+為反離子的陰離子多酸鹽{CoWn} n_揮發后留下的無規則結構薄膜；以及陽性對照DMS0);縱坐標表示相對增長速率。在實施例I、例3的基礎上，向多孔膜中加入不同濃度的正常細胞懸浮液(10^^30^^50% )，在37°C培養箱中培養，計細胞個數，運用MTT比色法進行細胞毒性實驗。MTT比色法是浸提液法的一種，該方法是在特定溫度條件下，按照一定的比例用細胞培養液對材料浸提，一定時間之后用該浸提液培養細胞，對受試材料溶出物的毒性檢測敏感性較高。其原理是當黃色水溶性的MTT加入活細胞后，即形成不溶于水的藍紫色結晶物甲臜，二甲基亞砜(DMSO)可使甲臜溶解，用分光光度計可以測定溶液的吸光度，吸光度的大小取決于甲臜形成的多少即活細胞的數量和其新陳代謝強度。RGR =(供試品組吸光度/空白對照組吸光度)X 100%。根據RGR將毒性分級如下0 級RGR 彡 100%；1 級80% 99%;2 級50% 79%;3 級30% 49%;4 級0% 29 %。各待測樣品的吸光度除以陰性對照的吸光度，得到的數值。該蜂窩狀多孔薄膜被認為是安全的，在低濃度下毒性等級是O級，在很高濃度下毒性為I級。
權利要求
1.一種制備抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法，其特征是，其步驟包括 (1)稱取以Br—或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑，備用； (2)以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液的制備 配制濃度為0. 06 0. 08克/升，以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液，使多酸鹽充分溶解，待用； (3 )以表面活性劑修飾的多酸鹽復合物溶液的制備 利用靜電相互作用，將步驟I配制的以Br_或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑加入到步驟2中配制好的以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液，以Br—或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑與以Na+為反離子的陰離子多酸鹽的物質的量之比為9:1-13:1 ;攪拌，使之充分混合； (4)以表面活性劑修飾的多酸鹽復合物的制備 將步驟3中的混合物過濾，棄上清，洗滌沉淀，干燥，得表面活性劑修飾的多酸鹽復合物； (5)多酸鹽復合物的氯仿溶液的制備 將步驟4中得到的復合物溶于氯仿，配制成濃度為I. (T2. 0克/升的溶液； (6)蜂窩狀多孔有序薄膜的制備 將步驟5制備的溶液滴加到固體基底上，通入潮濕的氣流，待溶劑完全揮發，得到蜂窩狀多孔有序薄膜。
2.如權利要求I所述的方法，其特征是，步驟I中所述以Br—或Cl—為反離子的陽離子表面活性劑具體選自雙十六烷基二甲基溴化銨或雙十八烷基二甲基氯化銨。
3.如權利要求I所述的方法，其特征是，步驟2中所述以Na+為反離子的陰離子多酸鹽水溶液具體選自多酸鹽Na11 [Coff11O39]。
4.如權利要求I所述的方法，其特征是，步驟6中氣流速度為lL/min。
5.權利要求1-4任一項所述的制備抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法制備的生物兼容薄膜。
6.權利要求5所述的生物兼容薄膜在制備細菌抑制劑中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征是，其在制備抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌的細菌抑制劑中的應用。
8.權利要求5所述的生物兼容薄膜在制備抗乙肝病毒藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的制備方法、產品及其應用，屬于新材料領域。本發明是利用水滴作為模板，在固體基底上形成規則有序的多孔薄膜。該薄膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等多種細菌具有抑制其生長的作用，且具有抗乙肝病毒功能。多次細胞毒性實驗證明該薄膜對正常細胞無毒。這種生物兼容性好的薄膜可用于污水處理、負載敷藥，在血液濾膜、細菌分離、細菌傳感器的制備以及肝病治療等方面具有重要的應用價值。該多孔薄膜中的孔徑可以通過改變其中表面活性劑的種類、濃度等方便地進行調節，從而滿足各種情形下的實際應用。
文檔編號A01N25/34GK102630670SQ20121008957
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者王妍然, 郝京誠, 郭曉輝 申請人:山東大學