專利名稱：一種水稻生物肥料及其制備方法以及枯草芽孢桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及農業技術領域，具體涉及一種水稻生物肥料及其制備方法以及枯草芽孢桿菌。
背景技術：
黑土指有機物質平均含量在3%至10%之間，特別利于水稻、小麥、大豆、玉米等農作物生長的一種特殊土壤。由于黑土地分布在四季分明的寒溫帶，植被茂盛，冷熱季節的更替，導致大量枯枝落葉腐化、分解，形成厚厚的、肥沃的黑土層，“寒地黑土”之稱由此而得。目前，寒地黑土的物產已成為世界綠色有機食品最好品質的代表。然而，寒地的低溫寒害是農業生產中一種嚴重的自然災害，涉及面廣，包括糧食 作物、蔬菜、果樹以及其他許多經濟作物，每年受此災害造成的損失十分巨大。例如，水稻的冷脅迫是影響其高產優質低耗的重要限制因素，中國每年因寒害而損失的稻谷產量高達30-50億千克。市場上有很多的水稻專用肥料，但大多數為無機復混肥料或有機-無機復混肥料，即將氮磷鉀按一定配比或將氮磷鉀和有機質按一定配比進行生產的肥料，這些肥料只是提供水稻所需的氮磷鉀養分，根本無法使水稻在低溫環境下呈現良好的生長態勢，如增加分蘗數、提前分蘗期、增加根重、加深葉色、提高水稻水溫等。中國專利申請號為200810137386. 5的專利公開了 “一種新型水稻專用微生物有機肥料的生產工藝”，其主要是通過改進吸附微生物的載體來提高微生物的活性，使微生物高效分解氮磷鉀供水稻吸收，但是在冷脅迫下并不能利于水稻生長，也沒有相關試驗數據來證明。中國專利申請號為201010595301. 5的專利公開了 “一種富硅富硒水稻專用微生物廢料及其制備方法”，其主要是在生物肥料的基礎上添加了中微量元素，使這種肥料在功效上有所提高，但也不能在冷脅迫下促使水稻呈現良好生長態勢。目前，市場上具有抗寒功效的水稻專用肥為水稻抗寒菌絲蛋白肥，申請號為200910072486. 9，這種肥料是利用玉米漿、玉米淀粉與葡萄糖，接種青霉菌進行發酵，發酵分兩次，共計8-13天，蛋白絲要進行烘干粉碎等工序，這就使這種肥料生產周期長，原料投入高，肥料的成本過高。雖然申請文件中說明能夠提高水稻的抗寒能力，但是該肥料只含有氮磷鉀養分，缺乏水稻生長過程中需求的其他有益物質，同時并未公開相關的試驗數據，故無法證明其能夠在冷脅迫下促使水稻呈現良好生長態勢。此外，該肥料的菌絲蛋白為酸性，主要針對堿性土壤使用，適用范圍受到限制。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的是提供一種水稻生物肥料及其制備方法以及枯草芽孢桿菌，使所述水稻生物肥料能夠在冷脅迫下促使水稻呈現良好生長態勢，如增加分蘗數、提前分蘗期、增加根重、加深葉色、提高水稻水溫等，且縮短肥料生產周期。
為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案一種水稻生物肥料的制備方法，包括以下步驟步驟I、將保藏編號為CGMCC No. 6190的枯草芽孢桿菌加到固體物料中發酵至枯草芽孢桿菌數至少為I. 2X IOltl個/g，且枯草芽孢桿菌芽孢率至少達到60%、雜菌率小于20%，得到發酵好的固體物料，所述固體物料由稻殼粉和花生殼粉中的任意一種、小麥麩皮、大豆餅粉、玉米粉、硫酸鎂、硫酸錳組成的固體混合物以及與所述固體混合物總重相同的水混合而成；步驟2、將發酵好的固體物料與腐殖酸、農用稀土、腐熟發酵后的禽畜糞便、硅鈣鎂肥料以及氨基酸肥料混合均勻即得水稻生物肥料。其中，所述固體物料以重量份計，優選由35-45份稻殼粉或 花生殼粉、45-55份小麥麩皮、4-6份大豆餅粉、4-6份玉米粉、0. 04-0. 06份硫酸鎂和0. 005-0. 015份硫酸錳的固體混合物以及與所述固體混合物總重相同的水混合而成，更優選為由40份稻殼粉或花生殼粉、50份小麥麩皮、5份大豆餅粉、5份玉米粉、0. 05份硫酸鎂和0. 01份硫酸錳的固體混合物以及與所述固體混合物總重相同的水混合而成。作為優選，步驟2所述用于混合的各組分以重量份計為，發酵好的固體物料5份、腐殖酸7. 7份、農用稀土 0. 3份、腐熟發酵后的禽畜糞便30-75份、硅鈣鎂肥料5份、氨基酸肥料5份。作為優選，步驟2還包括加入氮磷鉀肥料進行混勻步驟，且步驟2所述用于混合的各組分以重量份計為，發酵好的固體物料5份、腐殖酸7. 7份、農用稀土 0. 3份、腐熟發酵后的禽畜糞便30-75份、硅鈣鎂肥料5份、氨基酸肥料5份、氮磷鉀肥料不多于45份。所述氮磷鉀肥料為市售，其中氮、磷、鉀質量比優選為1:0. 5-0. 6:0. 6-0. 8。步驟I所述發酵的時間一般為2-3天，優選地，步驟I所述發酵的pH值為7. 0-7. 2。枯草芽孢桿菌不但具有促進增根、生根、壯根和提高蓄能和地溫等功能，另外誘導植物抗性也是枯草芽孢桿菌生防作用的重要機制之一。其產生的過氧化氫酶及其它酵素和酶等外分泌物對水稻生長均表現出不同程度的促進作用。本發明對野生型的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)進行誘變及馴化，使其活性更強，相同條件下數量也更多，產生各種它外分泌物的能力與量也得到提升，其中過氧化氫酶及其的能力相應增加，這些物質具有增加水稻植株的鮮重與干重，提高水稻葉綠素的含量，提高其保護酶活性，并通過提高水稻對外界環境的適應性，提高其抗寒等抗逆性，促進其更好地生長。本發明以市售野生型枯草芽孢桿菌為出發菌株，用含有稀土混合物的營養液在30°C、120r/min下培養12小時，然后選取強壯的菌株重復前述的培養步驟3_5次，而后選取強壯的菌株進行普通培養，當菌數達到IO7個/毫升，于500W的微波下處理30-45S，最終篩選得到一株誘變枯草芽孢桿菌，編號為HYOl。其中，所述營養液以重量份計，由100份牛肉浸汁、I份蛋白胨、0. 5份氯化鈉、0. 15份稀土混合物組成(氯化釓硝酸鈰重量比為2:1)，pH7. 2-7. 4。本發明將上述篩選出的菌株HYOl按照東秀珠、蔡妙英主編的《常見細菌系統鑒定手冊》的方法對其進行生理生化特性檢測，檢測結果與野生型枯草芽孢桿菌一致。此外，經16S DNA檢測分析，菌株HYOl與野生型枯草芽孢桿菌同源性高達99%，結合生理生化特征，鑒定其為枯草芽孢桿菌。
本發明所述枯草芽孢桿菌HYOl已于2012年6月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6190。 經過試驗證明，枯草芽孢桿菌HYOl過氧化氫酶等酶活性從原來的5800U/L提高到11500U/L,并且HYOl具有了適應更加惡劣環境的能力，其在溶液中受氮抑制濃度從6%提高到10%，各種活性和能力的提升能夠使HYOl更好地協調多種營養成分為水稻所利用，促使水稻在冷脅迫下呈現良好生長態勢。此外，為了配合枯草芽孢桿菌HYOl的高活性，本發明將其與腐殖酸、農用稀土、腐熟發酵后的禽畜糞便、硅鈣鎂肥料、氨基酸肥料以及氮磷鉀肥料混合，全面滿足水稻所需養分并在枯草芽孢桿菌HYOl的作用下增加水稻應對冷脅迫的能力。腐植酸和作為有機質的禽畜糞便不但可以提高肥料的利用率，而且可以提高水稻 的各種抗逆性。另外，在水田施用，由于腐植酸和有機肥料的顏色較深，使水田中水的顏色變深，可以更多的吸收日光，使水溫有一定的提升，可以增加水稻的出苗率、促進水稻及稻苗色變深，根系發達，增加水稻的有效分蘗，促進水稻的根系增長，使根系發達，從而增加水稻產量。本領域公知，禽畜糞便在使用前一般都需要進行腐熟發酵，以便產生有效肥分和腐殖質等物質，本發明可以采用本領域常規腐熟發酵方法來獲得腐熟發酵后的禽畜糞便，作為優選本發明所述腐熟發酵后的禽畜糞便由以下方法獲得以質量百分比計，將由70%的禽畜糞便、20%的草料或秸桿粉以及10%糠麩混勻而成的發酵物料進行腐熟發酵4-6天即得，腐熟發酵期間保持發酵物料水分含量在50-65%、發酵物料高度在0. 5-1. 2米、發酵物料溫度不高于70°C。其中，所述禽畜糞便可以為牛糞、雞糞、鴨糞、豬糞、鹿糞等常用禽畜糞便，可以選用一種或兩種以上。農用稀土可由市售獲得，為稀土元素的氧化物或硝酸鹽等，本發明優選REO ^ 40%的農用稀土。稀土元素對水稻生長形態、光合生理、養分吸收、產量及其構成因素具有一定促進作用。施用可有效促進水稻分蘗的發生、提高水稻根冠比以及水稻劍葉與倒2葉的葉綠素含量和葉片的光合速率。此外，稀土還可以利于秸桿中氮、磷元素向籽粒的轉移和籽粒中鉀元素在作物生長后期向秸桿的返流。硅鈣鎂肥料是作物生長所必須的中量元素，補充水稻生長所需養分，促進水稻根系發育、促進光合作用產物運輸與合理分配、提高氮磷鉀養分利用率、提高作物抗逆性等，而氨基酸肥料能夠補充有機氮的來源，同時將水稻所需的中量元素和微量元素(鈣、鎂、鐵、錳、鋅、銅、鑰、硼、硒等)攜帶到植物體內，提高植物對各種養分的利用率，利于水稻提升自身抗寒能力。所述硅鈣鎂肥料和氨基酸肥料均可市售獲得，作為優選，硅鈣鎂肥料優選為SiO2彡20%、CaO彡20%、MgO彡10%的硅鈣鎂肥料，更優選為SiO2彡25%、CaO彡30%、MgO ^ 10%的硅鈣鎂肥料；氨基酸肥料優選為N ^ 16%、有效氨基酸> 10%的氨基酸肥料，如長春大成集團的氨基酸有機質肥料。本發明還提供一種由本發明所述制備方法制備的水稻生物肥料，在與市售水稻抗寒菌絲蛋白肥、不含HYOl菌株的對照肥以及市售水稻無機肥的對比試驗中，本發明所述水稻生物肥能夠提高水稻分蘗數、提前水稻分蘗期、增加水稻根重、加深水稻葉色、提高水稻水溫。
此外，本發明還提供一種保藏編號為CGMCC No. 6190的枯草芽孢桿菌(即本發明誘變和馴化出的HYOl菌株)及其在制備水稻生物肥料中的應用。由以上技術方案可知，本發明利用誘變的枯草芽孢菌與雞糞等腐熟發酵處理的有機質、腐植酸、硅鈣鎂肥料、農用稀土、氨基酸肥料等物質混合，形成一種復合水稻微生物肥料，其在一定程度上能夠提高水稻分蘗數、提前水稻分蘗期、增加水稻根重、加深水稻葉色、提高水稻水溫，促使水稻在冷脅迫下更好的生長。生物保藏信息說明分類命名枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis于2012年6月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6190。·
具體實施例方式本發明公開了一種水稻生物肥料及其制備方法以及枯草芽孢桿菌，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品和方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明。實施例I :本發明所述枯草芽孢桿菌HYOl的篩選以市售野生型枯草芽孢桿菌為出發菌株，用含有稀土混合物的營養液在30°C、120r/min下培養12小時，然后選取強壯的菌株重復前述的培養步驟3_5次，而后選取強壯的菌株進行普通培養，當菌數達到IO7個/毫升，于500W的微波下處理30-45S，篩選最為強壯的菌株，命名為HY01。其中，所述營養液以重量份計，由100份牛肉浸汁、I份蛋白胨、0.5份氯化鈉、0. 15份稀土混合物組成(氯化釓硝酸鈰重量比為2:1)，pH7. 2-7. 4。將上述篩選出的菌株HYOl按照東秀珠、蔡妙英主編的《常見細菌系統鑒定手冊》的方法對其進行生理生化特性檢測，檢測結果與野生型枯草芽孢桿菌一致。此外，經16SDNA檢測分析，菌株HYOl與野生型枯草芽孢桿菌同源性高達99%，結合生理生化特征，鑒定其為枯草芽孢桿菌。實施例2 :禽畜糞便的腐熟發酵禽畜糞便牛糞、鹿糞、豬糞、雞糞；以質量百分比計，將70%的禽畜糞便、20%的草料或秸桿粉、10%糠麩混勻放置發酵槽，混勻物料高度在0. 5-1. 2米，發酵物料溫度升到60°C時，開始翻堆，控制溫度不超過700C，翻堆次數視發酵物料溫度而定，發酵過程一般4-6天完成，發酵好的物料蓬松狀、呈黑褐色，略帶香味或泥土味。實施例3 :制備本發明所述水稻生物肥料固體物料成分40份稻殼粉、50份小麥麩皮、5份大豆餅粉、5份玉米粉、0. 05份硫酸鎂和0.01份硫酸錳，料水比為I : I，隧道式微波滅菌，用氫氧化鈣等堿性物質調節PH值為 7. 0-7. 2 ；將保藏編號為CGMCC No. 6190的枯草芽孢桿菌加到固體物料中發酵至枯草芽孢桿菌數至少為I. 2 X 101°個/g，且枯草芽孢桿菌芽孢率至少達到60%、雜菌率小于20%，得到發酵好的固體物料；取發酵好的固體物料5份、腐殖酸7. 7份、農用稀土(REO ^ 40%) 0. 3份、實施例2的禽畜糞便50份、硅鈣鎂肥料(SiO2彡25%、CaO彡30%、MgO彡10%) 5份、氨基酸肥料(N ^ 16%、有效氨基酸> 10%) 5份、氮磷鉀肥料20份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。實施例4 :制備本發明所述水稻生物肥料固體物料成分35份稻殼粉、55份小麥麩皮、4份大豆餅粉、6份玉米粉、0. 04份硫酸鎂和0.015份硫酸錳，料水比為I : 1，隧道式微波滅菌，用氫氧化鈣等堿性物質調節pH值為 7. 0-7. 2 ；將保藏編號為CGMCC No. 6190的枯草芽孢桿菌加到固體物料中發酵至枯草芽孢桿菌數至少為I. 2 XlOltl個/g，且枯草芽孢桿菌芽孢率至少達到60%、雜菌率小于20%，得到發酵好的固體物料； 取發酵好的固體物料5份、腐殖酸7. 7份、農用稀土(RE0彡40%) 0. 3份、實施例2的禽畜糞便30份、硅鈣鎂肥料(SiO2彡25%、CaO彡30%、MgO彡10%) 5份、氨基酸肥料(N ^ 16%、有效氨基酸> 10%) 5份、氮磷鉀肥料45份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。實施例5 :制備本發明所述水稻生物肥料固體物料成分45份花生殼粉、45份小麥麩皮、6份大豆餅粉、4份玉米粉、0. 06份硫酸鎂和0. 005份硫酸錳，料水比為I: I，隧道式微波滅菌，用氫氧化鈣等堿性物質調節pH值為 7. 0-7. 2 ；將保藏編號為CGMCC No. 6190的枯草芽孢桿菌加到固體物料中發酵至枯草芽孢桿菌數至少為I. 2 X 101°個/g，且枯草芽孢桿菌芽孢率至少達到60%、雜菌率小于20%，得到發酵好的固體物料；取發酵好的固體物料5份、腐殖酸7. 7份、農用稀土(RE0彡40%)0. 3份、實施例2的禽畜糞便75份、硅鈣鎂肥料(SiO2彡20%、CaO彡20%、MgO彡10%) 5份、氨基酸肥料5份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。實施例6 :制備本發明所述水稻生物肥料固體物料成分40份花生殼粉、50份小麥麩皮、5份大豆餅粉、5份玉米粉、0. 05份硫酸鎂和0.01份硫酸錳，料水比為I : I，隧道式微波滅菌，用氫氧化鈣等堿性物質調節pH值為 7. 0-7. 2 ；將保藏編號為CGMCC No. 6190的枯草芽孢桿菌加到固體物料中發酵至枯草芽孢桿菌數至少為I. 2 X 101°個/g，且枯草芽孢桿菌芽孢率至少達到60%、雜菌率小于20%，得到發酵好的固體物料；取發酵好的固體物料5份、腐殖酸7. 7份、農用稀土(REO ^ 40%) 0. 3份、實施例2的禽畜糞便60份、硅鈣鎂肥料(SiO2彡20%、CaO彡20%、MgO彡10%) 5份、氨基酸肥料(N ^ 16%、有效氨基酸> 10%) 5份、氮磷鉀肥料10份混合造粒、干燥即得水稻生物肥料。實施例7 :水稻生長對比試驗委托長春金育農業科技研究所進行水稻生長對比試驗，選用肥料分別為本發明實施例3-6肥料、未添加枯草芽孢桿菌的對照肥料(按照實施例3各組分制備，區別在于不添加枯草芽孢桿菌，直接用固體物料混合造粒)、市售水稻無機肥料以及市售水稻抗寒菌絲蛋白肥，各種肥料處于相同的冷脅迫溫度(水溫設置為16°C左右，一般水溫16-20度，分蘗緩慢，低于16度，停止分蘗)下，種植環境一致，施肥量一致，結果見表I。表I水稻生長對比試驗結果
權利要求
1.一種水稻生物肥料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I、將保藏編號為CGMCC No. 6190的枯草芽孢桿菌加到固體物料中發酵至枯草芽孢桿菌數至少為I. 2 XlOltl個/g，且枯草芽孢桿菌芽孢率至少達到60%、雜菌率小于20%，得到發酵好的固體物料，所述固體物料由稻殼粉和花生殼粉中的任意一種、小麥麩皮、大豆餅粉、玉米粉、硫酸鎂、硫酸錳組成的固體混合物以及與所述固體混合物總重相同的水混合而成； 步驟2、將發酵好的固體物料與腐殖酸、農用稀土、腐熟發酵后的禽畜糞便、硅鈣鎂肥料以及氨基酸肥料混合均勻即得水稻生物肥料。
2.根據權利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟2所述混合的各組分以重量份計為，發酵好的固體物料5份、腐殖酸7. 7份、農用稀土 0. 3份、腐熟發酵后的禽畜糞便30-75份、硅鈣鎂肥料5份、氨基酸肥料5份。
3.根據權利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟2還包括加入氮磷鉀肥料進行混勻步驟。
4.根據權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述固體物料以重量份計，由35-45份稻殼粉或花生殼粉、45-55份小麥麩皮、4-6份大豆餅粉、4-6份玉米粉、0. 04-0. 06份硫酸鎂和0. 005-0. 015份硫酸錳的固體混合物以及與所述固體混合物總重相同的水混合而成。
5.根據權利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟I所述發酵的pH值為7.0-7. 2。
6.根據權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述農用稀土的REO^ 40%。
7.根據權利要求I所述制備方法，其特征在于，所述腐熟發酵后的禽畜糞便由以下方法獲得 以質量百分比計，將由70%的禽畜糞便、20%的草料或秸桿粉以及10%糠麩混勻而成的發酵物料進行腐熟發酵4-7天即得，腐熟發酵期間保持發酵物料水分含量在50-65%、發酵物料高度在0. 5-1. 2米、發酵物料溫度不高于70°C。
8.權利要求1-7任意一項所述制備方法制備的水稻生物肥料。
9.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于，保藏編號為CGMCC No. 6190。
10.保藏編號為CGMCCNo. 6190的枯草芽孢桿菌在制備水稻生物肥料中的應用。
全文摘要
本發明涉及農業技術領域，公開了一種水稻生物肥料及其制備方法以及枯草芽孢桿菌。該制備方法將保藏編號為CGMCC No.6190的枯草芽孢桿菌加到固體物料中發酵至枯草芽孢桿菌數至少為1.2×1010個/g，且枯草芽孢桿菌芽孢率至少達到60%、雜菌率小于20%，然后將發酵好的固體物料與腐殖酸、農用稀土、腐熟發酵后的禽畜糞便、硅鈣鎂肥料以及氨基酸肥料混勻即得水稻生物肥料。本發明利用誘變的枯草芽孢菌與雞糞等腐熟發酵的有機質、腐植酸、硅鈣鎂肥料、農用稀土、氨基酸肥料等物質混合，形成復合水稻微生物肥料，能夠提高水稻分蘗數、提前水稻分蘗期、增加水稻根重、加深水稻葉色、提高水溫，促使水稻在冷脅迫下更好的生長。
文檔編號C05F17/00GK102757277SQ20121026842
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月31日 優先權日2012年7月31日
發明者丁振生, 趙立春, 鄒建國 申請人:長春華御實業集團有限公司