專利名稱：一種利用組培袋模擬生態進行植物組織培養的方法
技術領域：
本發明涉及模擬植物生長外環境進行植物組織培養，具體是一種利用自粘組培袋擬生態進行植物組織培養的方法。
背景技術：
植物組織培養規?；a中多采用在無菌條件下，將離體植物器官(根、莖、葉、花、果實等)、組織(形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細胞(體細胞和生殖細胞)以及原生體，培養在人工配置的培養基上，進行脫出病毒、快速繁殖和保存種質資源。由于植物細胞具有全能性，在植物組織培養中，離體的組織和細胞接種到培養容器內培養獲得的小植株叫試管苗。采用植物組織培養方法可以使試管苗具有很高的繁殖速度。植物組織培養技術是當前生物工程中應用最廣泛，最有效的技術和方法，在園林、農林、藥用植物種植生產得到廣泛的應用。試管苗由于是在無菌、有營養供給、適宜光照和溫度近100%的相對濕度環境條 件下生長的，因此，在生理、形態等方面都與自然條件生長的小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應外界環境，從而使生理、形態、組織上發生相應的變化，使之更適合于自然環境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。從葉片上看，試管苗的角質層不發達，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現了大量的氣孔，而且，氣孔的數量、大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環境生長，當將它們移栽到試管外環境時，試管苗失水率會很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態特點，則必須經過與外界相適應的馴化處理。植物組織培養的培養基(液體培養基、固體培養基)，由細胞生長發育所必需的各種無機鹽(大量元素、微量元素等)、有機營養物(氨基酸、糖類等)、生物活性物質(維生素類等)、植物生長調節物質(細胞生長素、細胞分裂素等)、天然提取物(椰子乳、酵母提取物等)和水等所組成。也可在培養基中加入瓊脂等使之成為凝膠態的固體培養基。配制好的培養基需經過熱壓消毒方可使用。植物組織培養過程中可采用各種不同類型的容器來進行植物組織培養。一般的組培工廠及實驗室中玻璃培養瓶是廣泛應用的容器，各種大小的試管、廣口瓶、牛奶瓶、罐頭瓶等均可在生產中利用但在組培中只應使用硼硅酸鹽玻璃容器，鈉玻璃對某些植物材料組織可能是有毒的，重復使用更加明顯。目前在很多組培工廠及實驗室內，玻璃培養容器和制備培養基所需的其它玻璃器皿都已被塑料器皿取代，有些塑料容器可以進行高溫滅菌，有些塑料容器(特別是用于原生質體、細胞培養的容器)在出廠時即是有菌的，這種一次性消耗在國外已得到普遍應用，在國內也有生產應用。在培養、生產中，使用罐頭瓶并用塑料薄膜或塑料蓋封口以橡皮圈或棉線箍扎雖是一種經濟有效可重復使用的方法，但這種封口方法費時費事，不利于提高效率規模化生產。

發明內容
本發明的目的是提供一套方便、快捷、高效率、低成本、規?；睦媒M培袋模擬生態植物組織培養的方法。
為實現上述目的，本發明的技術方案是利用組培袋培養容器聚丙烯、BOPP光膜等耐高溫材料生產而成，替代玻璃瓶、塑料瓶、試管等組培容器，裝入一定量的植物組織培養的培養基水溶液及適合于栽種試管苗的擬生態培養基支撐物(蛭石、珍珠巖、松毛、陶化營養土、腐殖土、枯枝落葉、木屑、山沙、瓊脂等)，經過高溫高壓滅菌，在無菌條件下模擬植物生長外環境以降低試管苗在自然環境中的死亡率為目的，從而高效低成本的進行植物組織培養的規模化生產。具體通過以下步驟實現利用耐高溫材料制成耐高溫透明無毒的組培袋，裝入一定量的植物組織培養基水溶液及適合于栽種試管苗的生態培養基支撐物，經過高溫高壓滅菌，在無菌條件下模擬植物生長外環境，從而進行植物組織培養的規模化生產，具體步驟如下
1)組培袋為類似信封的矩形，長10 70cm、寬5 50cm、長口貼有自粘膠條，長口與短口的距離為I 5cm，具體大小可按不同植物組織培養的需要進行可大可小、可長可短的 調整；
2)在組培袋內裝入培養基水溶液與生態培養基支撐物，所述的生態培養基支撐物為蛭石、珍珠巖、松毛、陶化營養土、腐殖土、枯枝落葉、木屑、山沙、瓊脂中的一種，控制溫度在119 125°C的條件下滅菌3(T50分鐘，然后無菌接種，進行無菌條件下的植物組織培養至得到試管苗；
3)在試管苗移栽到大棚等外環境條件下時，破開組培袋一部分進行帶袋移栽，保留組培袋內的全部或部分培養基水溶液及擬生態培養基支撐物，或取袋移栽或直接種植試管苗。在植物組織培養時，可根據需要在組培袋中加入適合植物生長的伴生植物苔蘚
坐寸o在進行培養基MS裝入時，應掌握好培養基水溶液與擬生態培養基支撐物(固體基質)的比例，一般以擬生態培養基支撐物潮濕不漂浮為佳(不同植物組織可進行適當調整)。裝好培養基MS組培袋進行裝鍋時使組培袋盡量直立，袋子與袋子之間盡量不要疊落在一起，每鍋裝袋數量應控制在同等條件下玻璃瓶的41倍之間，不宜過份裝多以免出現培養基溢出。利用組培袋擬生態植物組織培養進行無菌接種操作與傳統的玻璃瓶操作類似，接種植物組織時可根據須要確定是丟投或是扦插植物組織，也可分為留母袋或是與不留母袋留母袋時，剪刀、鑷子等一些操作工具應盡量選擇長度相對適合袋子規格的，并在操作中避免出現碰到袋子長口(貼有自粘膠條)，在無菌接種完畢后將母袋袋口頂部下折r3圈，再用經過高溫滅菌可重復使用的金屬夾子夾住折口(子袋也是一樣)。不留母袋時，應備用一把不經消毒的剪刀進行剪袋(沿袋子左側或右側邊緣約0. 2^0. 5cm處由下往上全部剪開，并沿自粘組培袋底部邊線一分為二用手撕開)，剪袋時需避免碰到袋內植物組織，袋子外部兩個面(外側面)平放在無菌工作臺桌面上，將袋子內部兩個面(內側面)當作無菌紙在其上進行無菌接種操作。組培袋擬生態植物組織培養每人每天(8小時/天)人均無菌接種速度遠高于玻璃瓶。在同等條件下每人每天人均接種自粘組培袋擬生態植物組織方法是玻璃瓶(傳統方式)的2 4倍。無菌接種完畢后，采取掛袋的方式進行上架培養更節約培養室空間及成本。在培養架各層支架間拉上金屬線或其他材料(塑料線等)，以每夾2袋為例以2袋間的空隙掛到金屬線或其他材料(塑料線等)線上，這種掛袋上架方式遠快于傳統方式并在很大程度上的節約了培養室空間及培養架成本。在同等條件下自粘組培袋擬生態植物組織培養節約的培養室空間是玻璃瓶培養的4飛倍，培養架放置植物組織節約的成本是玻璃瓶的3飛倍。 若需要還可在組培袋中加入(滅菌前)適合植物生長的伴生植物(苔蘚等)，模擬出一個符合植物特性、適合植物生長的環境，進行無需馴化、煉苗、移栽的無菌操作及培養過程，直接在組培實驗室或規?；M培工廠車間中形成商品產生經濟效益。本發明是利用組培袋達到模擬植物生長外環境進行植物組織培養，以組培袋替代傳統容器(玻璃瓶等)，以適合于栽種試管苗的各類基質模擬植物生長外環境替代(或不替代)高成本膠狀培養基(瓊脂等)，加上同固體培養基一起栽種組織苗，均衡植物所需要的營養既環保又不浪費基質，還在傳統無菌接種操作的基礎上采取投苗方式接種等進行植物組織培養的創新。相對于傳統玻璃瓶等容器的重復使用的高污染率、移栽成活率低等而言，本發明采取模擬植物生長外環境進行植物組織培養，所產生的組培苗無需馴化、假植(煉苗) 等，在組培苗移栽時還能將擬生態植物組織的培養基水溶液及支撐物全部與組培苗同時移栽下地，無需清洗組培苗基部及丟失任何營養物質(培養基水溶液及支撐物)，達到植物組織培養與組培苗移栽過程一體化。其在利用自粘組培袋進行植物組織培養接種污染率平均數為1%以下，在攜代營養物質移栽組培苗成活率平均數為98%以上。雖然自粘組培袋相對于玻璃瓶等是一次性使用顯得成本高，但實際上減去了支付洗瓶人工費、水費、電費等及高利用率的高壓滅菌的裝鍋數量，高效率的無菌接種生產速度和培養室空間的高利用率，以及在組培苗的運輸、煉苗等成本都得到了降低，在規?；a條件下成本遠低于傳統技術的5 —10倍，使組培工廠化規?；纳a及實驗室的研究更加方便、簡單、快捷，易監督、易管理、低成本、高效益。
具體實施例方式組培袋的制備利用耐高溫材料聚丙烯、或BOPP光膜制成耐高溫透明無毒的組培袋，組培袋的規格為類似信封的矩形組培袋長l(T70cm、寬5飛0cm、長口貼有自粘膠條，與短口的距離為f5cm。裝入一定量的植物組織培養基MS培養基水溶液(每升MS水溶液含有40倍母液的25ml大量元素、200倍母液的5 ml鐵鹽、1000倍母液的Iml微量元素、200倍母液的5ml有機物)和生態培養基支撐物、食用白糖10-50g/L ;培養基水溶液與生態培養基支撐物固體基質的比例以生態培養基支撐物潮濕不漂浮為佳；將貼有自粘膠條的袋子頂部向下折廣2厘米，待冷卻后方可進行無菌接種；
實施例I :
馬鈴薯的組培袋模擬生態進行植物組織培養方法按以下方法進行
先將已經過高低、溫處理的馬鈴薯外植體自來水沖洗3— 5分鐘，并按規格取健康頂芽部分，在無菌條件下用0. 1%升汞浸泡10—25分鐘，隨即用無菌水沖洗2—3次，每次時間大約3— 5分鐘，沖洗后的馬鈴薯外植體芽放入以上所述的裝有MS培養基[每升MS水溶液含有25ml大量元素(40倍母液)、5ml鐵鹽(200倍母液)、lml微量元素(1000倍母液)、5ml有機物(200倍母液)]的組培袋中，在PH5. 8、溫度20°C以上、25°C以下、光照充足的環境中采取掛袋的方式培養1(T15天(在培養架各層支架間拉上金屬線或其他線材，以2袋間的空隙掛到金屬線或其他線材上進行植物組織培養)即可通過解剖鏡進行莖尖剝離、組織培養、病毒檢測、組織培養繼代擴繁健康組培苗，可選用珍珠巖粉作培養基支撐物，當健康組培苗生長到可I袋(苗高5 7cm)轉接3袋或更多的時候，即可進行組培苗繼代擴繁，每隔If 25天繼代一次，增值系數為1:3 1:6。繼代培養過程中的溫度為20°C以上、25°C以下、光照充足并配備一定數量的日光燈以保證夜間光照。在繼代操作中組培苗污染率為1%以下，人均每天工作8小時接苗(袋每袋15 20苗)數為400飛00袋。此方法與傳統組培相比較，因選用珍珠巖代替了瓊脂作為培養基支撐物，并且自粘組培袋擁有良好透光性等物理特性，從而模擬出一個適合馬鈴薯試管苗生長的外環境，既降低了成本又無須進行傳統的試管苗馴化煉苗過程。用自粘組培袋進行擬生態(珍珠巖粉)組培馬鈴薯試管苗，代替了玻璃瓶等傳統組培容器及傳統的培養基支撐物(瓊脂粉)，提高了高壓鍋等設備利用率及人工效率，避免了洗瓶等重復利用所帶來的成本及二次污染，在無菌接種過程中因所有操作均簡化，也提高了組培苗在外環境中的成活率及人工效率，更適合進行低成本規?；a。
實施例2:
花卉的組培袋模擬生態進行植物組織培養方法按以下方法進行
與實施例I不同的是，例如在進行非洲菊組織培養，需在MS中每升添加植物生長調節物質 0. 1—1. Oml [BA (lg/L)]與 0. 01—0. 5ml[NAA (lg/L)]和白糖(20—30g/L)并根據選擇種植方式的不同在自粘組培袋中加入不同的培養基支撐物如蛭石、陶化營養土、腐殖土、瓊脂粉等中的一種。其無菌接種方式與傳統方式類似，但由于自粘組培袋的特性，在組培苗移栽到大棚等條件時，可選擇破袋帶袋移栽，也可選擇取袋無需馴化煉苗直接帶袋種植單株或多株移栽。實施例3:
塊根、塊莖和球莖的組培袋模擬生態進行植物組織培養方法按以下方法進行
與實施例I不同的是，在進行魔芋塊莖操作時需進行溫度在20°C的適當遮陰處理，在實施例I培養基的基礎上，并根據選擇種植方式的不同在自粘組培袋中加入培養基支撐物如陶化營養土、腐殖土、珍珠巖粉、瓊脂粉等中的一種，在MS培養基中加入植物生長調節物質0. 3^2. 5ml [BA (lg/L)]與0. Of 0. 5ml [NAA (lg/L)]。其無菌接種方式與傳統方式類似。因組培袋的使用一次性及大小規格的多樣性，在進行塊根、塊莖和球莖的組培操作時，可按比例適當增加植物組織的體形，盡量保證為長條形，這樣在植物組織產生愈傷組織后在不用打開自粘組培袋的情況下，根據情況用手將長條狀的植物組織掰斷進行隔袋操作，無須繼代轉接，防止污染、減少程序、達到一次成苗之效果。實施例4:
藥材的組培袋模擬生態進行植物組織培養方法按以下方法進行
與實施例1、2、3不同的是，在進行石斛組織培養時，在實施例I培養基的基礎上，根據選擇種植方式的不同在自粘組培袋中加入不同的培養基支撐物如蛭石、珍珠巖、松毛、陶化營養土、腐殖土、枯枝落葉、木屑、山沙、瓊脂等中的一種，并每升添加植物生長調節物質1.0-3. Oml [BA (lg/L)]與 0. 01 — I. Oml [NAA (lg/L)]，腐殖土在與培養基高壓滅菌前，需先高溫滅菌4飛小時。其無菌接種方式與傳統方式類似。
權利要求
1.一種利用組培袋擬生態植物組織培養的方法，其特征是利用耐高溫材料制成耐高溫透明無毒的組培袋，裝入一定量的植物組織培養基水溶液及適合于栽種試管苗的生態培養基支撐物，經過高溫高壓滅菌，在無菌條件下模擬植物生長外環境，從而進行植物組織培養的規?；a，具體步驟如下 1)組培袋為類似信封的矩形，長10 70cm、寬5 50cm、長口貼有自粘膠條，長口與短口的距離為I 5cm ； 2)在組培袋內裝入培養基水溶液與生態培養基支撐物，所述的生態培養基支撐物為蛭石、珍珠巖、松毛、陶化營養土、腐殖土、枯枝落葉、木屑、山沙、瓊脂中的一種，然后無菌接種，進行無菌條件下的植物組織培養至得到試管苗； 3)在試管苗移栽到大棚等外環境條件下時，破開組培袋一部分進行帶袋移栽，保留組培袋內的全部或部分培養基水溶液及擬生態培養基支撐物，或取袋移栽或直接種植試管苗。
2.根據權利要求I所述的利用組培袋擬生態植物組織培養的方法，其特征是在植物組織培養時，在組培袋中加入適合植物生長的伴生植物苔蘚。
全文摘要
本發明是一種利用組培袋模擬生態植物組織培養的方法。利用耐高溫材料制成耐高溫透明無毒的組培袋，裝入一定量的植物組織培養基水溶液及適合于栽種試管苗的生態培養基支撐物，經過高溫高壓滅菌，在無菌條件下模擬植物生長外環境，從而進行植物組織培養的規?；a。本發明減去了支付洗瓶人工費、水費、電費等及高利用率的高壓滅菌的裝鍋數量，高效率的無菌接種生產速度和培養室空間的高利用率，組培苗的運輸、煉苗等都降低了成本，使組培工廠化規?；纳a及實驗室的研究更加方便、簡單、快捷，易監督、易管理。
文檔編號A01H4/00GK102742508SQ201210279359
公開日2012年10月24日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者秦琪書, 謝慶華 申請人:昆明琪鼎權生物科技有限公司