專利名稱：一種黃河鲇三倍體的誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種魚類多倍體的誘導方法，特別是一種黃河鲇三倍體的誘導方法。
背景技術：
黃河鲇(Silurusasotus)隸屬鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridae)、鲇屬(Silurus)，是我國黃河流域分布廣泛的一種優良淡水經濟魚類。其肉嫩味美，不具肌間刺，營養價值高，易實現產業化養殖。染色體組操作在魚類育種中占有重要地位。二十世紀后期，國內外水產養殖業發展迅速，因而以提高養殖魚類產量和質量為主要目的的染色體操作已成 為魚類育種的熱點。所謂染色體操作是通過物理或化學方法改變生物體內的染色體組成的一種生物技術。多倍體(polyploid)系指生物體體細胞中含有超過2個染色體組的個體。相對于二倍體，多倍體含有3個、4個或更多的染色體組，而依次被稱為三倍體(triploid)、四倍體(tetroploid)和五倍體(pentaploid)等。在水產動物中現在研究最多的是三倍體。多倍體是由于細胞內染色體加倍而形成的，染色體加倍則通過卵子第二極體的保留或受精卵早期有絲分裂的抑制而實現。根據魚類受精細胞學的研究，精子入卵的時間是在第二次成熟分裂的中期，受精后排出第二極體。如果卵子受精后不排出第二極體，即它們不經過正常的減數分裂，形成了二倍體卵核，與單倍體精核結合后，就形成了三倍體。三倍體魚主要有以下優勢多倍體魚類具有比較強的生活力、適應性和生長勢；三倍體魚類還具有抗病力強、肉質鮮美等特點；另外，三倍體魚類是不育的，除了能提高生長速度外，對種質資源的保護也有重要意義，不至于因逃逸對野生資源造成遺傳混雜。
目前三倍體的誘導方法有以下幾種化學誘導三倍體的方法目前主要的化學誘導劑有細胞松弛素B( CB)、6_ 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇(PEG)等。其缺點是成功率低；試驗材料(受精卵)能用于試驗處理的數量也受到限制；有些誘導劑毒性較大，有致癌性，難溶于水，且價格昂貴。物理誘導三倍體方法主要有溫度休克法、靜水壓法、電融合法和高鹽高堿法等。溫度休克法和靜水壓法較常用而且效果較好。溫度休克處理誘導率低，且死亡率較高；靜水壓處理需要專門設備，成本較高，樣本容量有限。生物學誘導三倍體方法可以分為遠緣雜交、核移植、細胞融合等3種。文獻報道較多的是雜交，尤其是種間雜交的方法。周期較長、誘導率較低。

發明內容
本發明的目的是提供一種誘導黃河鲇三倍體簡單、易操作、不需要專用設備和誘導成功率高、周期短的一種黃河鲇三倍體的誘導方法。實現本發明目的的技術方案是，一種黃河鲇三倍體的誘導方法，其特征在于有以下步驟
(I)人工催產用量為5000IU/kg鲇體的絨毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇體的人工合成促黃體素釋放激素對黃河雌鲇親魚進行催產，對黃河雄鲇親魚的催產用量為上述雌鲇用量的一半，上述催產均為一次性注射，催產后放入21 — 30 °C曝氣自來水中培育，效應時間為 8—12h ；
(2)人工受精待黃河鲇親魚發情時，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫為25°C的曝氣自來水中，攪拌均勻，使精卵充分結合；
(3)三倍體誘導用濃度為25mg/kg的秋水仙素，對上述受精卵進行處理
秋水仙素開始處理的時間為3 —15分鐘，持續時間為25—35分鐘，得到三倍體黃河鲇。本發明與現有技術比較具有方法簡單、容易操作、不需要專用設備和誘導成功率高、周期短的顯著優點。



圖I是本發明黃河鲇三倍體誘導方法流程方框圖。具體實施方法
結合上述流程方框圖對本發明作詳細描述，本發明有以下步驟
(1)人工催產對黃河鲇親魚采用絨毛膜促性腺激素(HCG)和促黃體素釋放激素或其類似物(LRH-A)進行催產。雌鲇劑量為HCG 5000 IU* kg ^+LRH-A 25 gg^kg-1，雄鲇劑量減半，均一次性注射，催產后放入30 °C曝氣自來水中培育，效應時間10 h左右；
(2)人工受精待黃河鲇親魚發情時，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫25°C的曝氣自來水，攪拌均勻，使精卵充分結合；
(3)三倍體誘導
A.秋水仙素的使用劑量25mg/L
B.秋水仙素開始處理的時間
精卵結合后，設計5 min、15 min、25 min、35 min 4種秋水仙素浸泡起始時間，持續浸泡30 min,以確定最佳秋水仙素浸泡起始時間。
起始時間(min) I存活率(％) I畸形率(％) _
5~ 19. I32.2
15~ 11.357.0
25~ 12.341.8
35~9.861. 3
O (對照組)170. 413. I—根據實驗結果，受精后5min開始進行秋水仙素處理，誘導效果最佳，存活率最高，達到19. 1%。C.秋水仙素處理的持續時間
在受精后5 min，分別采用秋水仙素持續浸泡處理10 min、20 min、30 min、40 min 4種組合，做為秋水仙素浸泡持續處理時間，以確定秋水仙素浸泡處理最佳持續時間。
處理時間(min) I存活率(％)I畸形率(％)—
10~9.858. 3
20~8. 742.8
30— 17.430.4
40— 10.237.8
O(對照組)|69· 2\2. 3—根據實驗結果，用秋水仙素處理30min,誘導效果最佳,存活率最聞，達到17.4%。倍性檢測用染色體制片法檢測誘導黃河鲇魚的倍性，三倍體黃河鲇誘導率達到19. 1%。
本發明技術方案帶來的有益效果
提供了一種誘導黃河鲇三倍體簡單、易操作的方法，誘導率高、周期短，適宜批量進行，易于大規模推廣。
權利要求
1.一種黃河鲇三倍體的誘導方法，其特征在于有以下步驟 (1)人工催產用量為5000IU/kg鲇體的絨毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇體的人工合成促黃體素釋放激素對黃河雌鲇親魚進行催產，對黃河雄鲇親魚的催產用量為上述雌鲇用量的一半，上述催產均為一次性注射，催產后放入21 — 30 °C曝氣自來水中培育，效應時間為 8—12h ； (2)人工受精待黃河鲇親魚發情時，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫為25°C的曝氣自來水中，攪拌均勻，使精卵充分結合； (3)三倍體誘導用濃度為25mg/kg的秋水仙素，對上述受精卵進行處理 秋水仙素開始處理的時間為3 —15分鐘，持續時間為25—35分鐘，得到三倍體黃河鲇。
全文摘要
本發明公開了一種黃河鲇三倍體的誘導方法，(1)人工催產用量為5000IU/kg鲇體的絨毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇體的人工合成促黃體素釋放激素對黃河雌鲇親魚進行催產，對黃河雄鲇親魚的催產用量為上述雌鲇用量的一半，上述催產均為一次性注射，催產后放入21—30℃曝氣自來水中培育，效應時間為8—12h；(2)人工受精待黃河鲇親魚發情時，將親魚撈起，擦干體表，擠出雌鲇卵子于干凈碗中，同時用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水溫為25℃的曝氣自來水中，攪拌均勻，使精卵充分結合；(3)三倍體誘導用濃度為25mg/kg的秋水仙素，對上述受精卵進行處理秋水仙素開始處理的時間為3—15分鐘，持續時間為25—35分鐘，得到三倍體黃河鲇。
文檔編號A01K61/00GK102812914SQ20121033805
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者李學軍, 李愛景, 程果, 彭新亮, 喬志剛, 聶國興, 孔祥會 申請人:河南師范大學