一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法。該方法包括：(1)優選出抗逆性好、生長快、莖稈粗、莖高長、分蘗多、纖維含量低、藥效成分含量高的不同產地的霍山石斛品種作為三倍體培育源植株親本；(2)對源植株種子在固體培養基中進行無菌播種，獲得原球莖；(3)對源植株花粉在固體培養基中進行無菌培養，獲得花粉細胞群；(4)制備花粉細胞和原球莖細胞的原生質體，進行細胞融合；(5)在固體培養基上對融合細胞進行培養分化成幼株，檢測出三倍體植株；(6)對三倍體植株進行組培，獲得大量三倍體幼苗。
【專利說明】一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及蘭科石斛屬藥用植物生物育種方法，特別涉及一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法。

【背景技術】
[0002]霍山石斛(學名:Dendrobiumhuoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng) 在國際上有“藥界大熊貓”之稱的野生霍山石斛，史稱霍石斛，俗稱米斛，距今已有200
多年的歷史。原產于我國安徽大別山等地，是國家現代中藥重大專項200多個瀕危稀缺品種中首位保護品種。是藥用石斛中的極品，也是霍山縣獨有的、擁有原產地地理標志的名貴中藥材，歷史上被譽為“中華九大仙草之首”、“健康軟黃金”。《神農本草》、《本草綱目》均有記載。霍山石斛所含有的多糖、生物堿類物質有清咽利嗓，保肝明目、降糖降脂、延年益壽之功效。本品能大幅度提高人體內SOD(延緩衰老的主要物質)，在增強免疫力、抗疲勞、延緩衰老和促進癌細胞凋亡等方面有明顯作用，從而達到保健保健的功效。
[0003]多倍體育種是植物新品種培育的重要手段，多倍體育種起源于20世紀初，現在已廣泛應用于植物新品種的培育中。多倍體由于基因組倍性的增加，往往表現出形態上的巨大性和抗性增強等特點。其中三倍體還具有不育特點，即可作為永久雜種，也有利于商業保護。
[0004]通過基因組三倍化，可以獲得具有多倍體和雜交種雙重優勢的三倍體，其優勢表現出具有巨大性和不可替代性，可以提高霍山石斛藥材產量、品質和抗逆性。三倍體霍山石斛則具有產量和質量上的雙重優勢。
[0005]國家“十一五”和“十二五”計劃均提出“種質資源的挖掘、保存、創新和新品種的定向培育”的任務。為貫徹、落實這項任務，我們倡導應用“基因組多倍化與融合雜交相結合”的方法，實現種質資源的創新和新品種的定向培育的目的。目前僅有三倍體鐵皮石斛和春石斛蘭的培育方法已公開并授權，迄今為止，三倍體霍山石斛(染色體核型指數為2n=3x=57)及培育方法還未見有公開報道。


【發明內容】

[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，該方法培育出的三倍體霍山石斛與二倍體霍山石斛相比，其主要形態性狀基本相同，但其莖、葉、花表現出明顯的增大，產量與多糖含量顯著提高，抗逆性增強。本發明產生的三倍體霍山石斛具有多倍體和雜交種的雙重優勢。
[0007]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:
一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，包括以下步驟:
步驟(I)中所述霍山石斛為分布在大別山山系的不同產地具有優良性狀的品種，其中高緯度、高海拔地區的品種具有抗逆性強、莖桿粗、藥效成分含量高的特點，低緯度、低海拔地區的品種具有生長速度快、莖高長、分蘗多、纖維含量低的特點。
[0008]步驟(2)和步驟(3)中所述培養為固體培養基培養，適合脫分化形成愈傷組織的培養基均可。優選大量元素減半的1/2MS培養基，調整蔗糖濃度為5%-8%，優選添加10-15%的椰乳，2，4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L ;培養溫度在25_18°C的晝夜溫差范圍內，光照時間10-12小時，光照強度2000-3000Lux，色溫在4500_5500k。
[0009]步驟(4)中所述原生質體的制備方法為常規的酶解法制備，細胞融合辦法優選電擊融合法。對花粉細胞和原球莖細胞的原生質體進行細胞融合，是為短時期內獲得雜交種而設計的辦法。如果利用四倍體植株與二倍體植株開花授粉，再組培成幼苗完成三倍體大量制備，最快需要2年，因為四倍體植株從組培苗到正常開花至少需要I年，從授粉到結實，需要5個月，種子培養成幼苗需要6-8個月。而三倍體融合細胞在驗證成功后，再培養成幼苗只需要6-8個月，大大縮短了育苗周期。
[0010]步驟(5)中所述檢測染色體倍數采用常規染色鏡檢辦法，選取染色體數目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體，在檢測過程中會發現二倍體或四倍體，這些分別是花粉細胞或體細胞融合形成的。
[0011]本發明包括上述任何一項培育方法得到的三倍體霍山石斛。
[0012]本發明有益效果:
本方法先分別培養霍山石斛種子和霍山石斛花粉形成愈傷組織，再分別制備愈傷組織的原生質體，經原生質體融合形成三倍體。該三倍體霍山石斛培育方法步驟簡單，能顯著縮短育種時間。由這種方法培育出的三倍體霍山石斛與二倍體霍山石斛石斛相比，其主要形態性狀基本相同，但其莖、葉、花表現出明顯的增大，產量與多糖含量顯著提高，抗逆性增強，具有多倍體和雜交種的雙重優勢。

【具體實施方式】
[0013]下面以實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不局限于這些實施例，本領域的技術人員對本
【發明內容】
的技術特征所作的等同替換，或相應的改進，仍屬于本發明的保護范圍之內。
[0014]為方便描述，以下實施例中用“品種A”表示高緯度、高海拔地區的染色體核型指數為2n=2x=38的霍山石斛品種，該品種具有抗逆性強、莖桿粗、藥效成分含量高的特點；用“品種B”表示低緯度、低海拔地區的染色體核型指數為2n=2x=38的霍山石斛品種，該品種具有生長速度快、莖高長、分蘗多、纖維含量低的特點。
[0015]實施例1
(1)將品種A和品種B的植株按常規方法種植栽培；
(2)對上述品種A的種子在固體培養基中進行無菌播種，獲得原球莖的愈傷組織，固體培養基為大量元素減半的1/2MS培養基，添加0.2g/L 2，4-D和0.2g/L NAA,調整蔗糖濃度為5%-8%，添加10-15%的椰乳，培養溫度在25-18 V的晝夜溫差范圍內，光照時間10-12 h，光照強度 2000-3000 Lux，色溫在 4500-5500 K ；
(3)對上述品種B的花粉在固體培養基中進行無菌培養，獲得花粉細胞群，固體培養基為H培養基，添加0.5g/L 2，4-0和1.5 g/L NAA,培養溫度在25-18 1:的晝夜溫差范圍內，光照時間10-12 h，光照強度2000-3000 Lux，色溫在4500-5500 K ；
(4)制備花粉細胞和原球莖細胞的原生質體，進行細胞融合，原生質體的制備方法為酶解法制備，細胞融合辦法采用電擊法；
(5)在固體培養基上對融合細胞進行培養分化成幼株，檢測出三倍體植株，取細胞組織染色壓片，鏡檢驗證染色體倍數，選取染色體數目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體；
(6)對三倍體植株進行無性組培，獲得大量三倍體幼苗，幼苗培育成成株，成株具有抗逆性強、莖桿粗、莖高長、分蘗多、生長速度快、纖維含量低、藥效成分含量高的特點，其中總多糖含量達21%。
[0016] 實施例2
(1)將品種A和品種B的植株按常規方法種植栽培；
(2)對上述品種B的種子在固體培養基中進行無菌播種，獲得原球莖的愈傷組織，固體培養基為大量元素減半的1/2MS培養基，添加0.2g/L 2，4-D和0.2g/L NAA,調整蔗糖濃度為5%-8%，添加10-15%的土豆汁，培養溫度在25-18 °C的晝夜溫差范圍內，光照時間10-12h，光照強度 2000-3000 Lux，色溫在 4500-5500 K ；
(3)對上述品種A的花粉在固體培養基中進行無菌培養，獲得花粉細胞群，固體培養基為H培養基，添加0.5g/L 2，4-0和1.5 g/L NAA,培養溫度在25-18 1:的晝夜溫差范圍內，光照時間10-12 h，光照強度2000-3000 Lux，色溫在4500-5500 K ；
(4)制備花粉細胞和原球莖細胞的原生質體，進行細胞融合，原生質體的制備方法為酶解法制備，細胞融合辦法采用電擊法；
(5)在固體培養基上對融合細胞進行培養分化成幼株，檢測出三倍體植株，取細胞組織染色壓片，鏡檢驗證染色體倍數，選取染色體數目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體；
(6)對三倍體植株進行無性組培，獲得大量三倍體幼苗，幼苗培育成成株，成株具有抗逆性強、莖桿粗、莖高長、分蘗多、生長速度快、纖維含量低、藥效成分含量高的特點，其中總多糖含量達20%。
【權利要求】
1.一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)優選出抗逆性好、株型大、生長快、藥效成分含量高的不同產地的霍山石斛品種作為二倍體培育源植株； (2)對源植株種子在固體培養基中進行無菌播種，獲得原球莖； (3)對源植株花粉在固體培養基中進行無菌培養，獲得花粉細胞群； (4)制備花粉細胞和原球莖細胞的原生質體，進行細胞融合； (5)在固體培養基上對融合細胞進行培養分化成幼株，檢測出三倍體植株； (6)對三倍體植株進行無性組培，獲得大量三倍體幼苗。
2.按照權利要求1所述的利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(I)中所述霍山石斛為分布在大別山山系的不同產地具有優良性狀的品種，其中高緯度、高海拔地區的品種具有抗逆性強、莖桿粗、藥效成分含量高的特點，低緯度、低海拔地區的品種具有生長速度快、莖高長、分蘗多、纖維含量低的特點。
3.按照權利要求1所述的利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(2)和步驟(3)中所述培養為固體培養基，適合誘導愈傷組織的培養基均可，優選大量元素減半的1/2MS培養基，調整蔗糖濃度為5%-8%，優選添加10-15% 的椰乳，2，4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L ;培養溫度在 25_18°C 的晝夜溫差范圍內，光照時間10-12小時，光照強度2000-3000Lux，色溫在4500_5500k。
4.按照權利要求1所述的利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(4)中所述原生質體的制備方法優選酶解法制備，原生質體融合辦法優選電擊融合法。
5.按照權利要求1所述的一種三倍體霍山石斛的培育方法，其特征在于:步驟(5)中所述檢測染色體倍數采用常規染色鏡檢辦法，選取染色體數目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體。
6.權利要求1-5中任何一項所述培育方法得到的三倍體霍山石斛。
【文檔編號】A01H4/00GK104429939SQ201410343440
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】鄧輝, 姚厚軍, 張德華, 楊國棟, 陳乃東 申請人:皖西學院