專利名稱：巨瓣兜蘭組培快繁方法
技術領域：
本發明涉及生物工程的植物組織培養繁育方法，特別是涉及一種巨瓣兜蘭組培快繁方法。背景方法
蘭科植物是自然界最大的家族之一，是有花植物中最為龐大和進化水平極高的類群之一，在被子植物當中僅次于菊科和禾本科位于第三大科。全 世界的蘭科植物約有700屬、20000種-30000種，廣泛分布于從溫帶、亞熱帶到熱帶的廣大區域。我國已發現并定名的蘭花約170余屬1300余種，其中2/3為附生蘭，1/3為地生蘭。目前，整個蘭科植物已被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄I或II。貴州是一個喀斯特地貌廣泛發育的高原省份，在地理環境上屬于亞熱帶氣候，具有獨特復雜的地形地貌、植被類型多樣和良好的水熱條件，適宜多種植物繁衍生息，同時也孕育了較豐富的蘭花資源。貴州省境內分布有蘭科植物約76屬320余種，包括大量的變種及品種。覽蘭屬(Paphiopedilum Pfitz)植物是蘭科植物最具欣賞價值的物種之一,覽蘭由于獨特的花朵造型、絢麗的花朵色彩、持久的觀賞花期而具有極高的觀賞價值，是國際上栽培最廣泛的蘭花之一，我國近年來兜蘭市場也在迅速擴大。我國是世界兜蘭屬的重要分布地和許多新種的模式產地。巨瓣5 蘭〔Paphiopedilumbellatulum(Rchb. f. ) Stein)屬蘭科(Orchidaceae)3 蘭屬(Paphiopedilum)的多年生草本植物,分布廣西、云南以及貴州等地,生于石灰巖地區，地生或石上附生植物，葉4-5枚，上面有深淺綠色相間的網格斑；花通常I朵，白色或奶油黃色，具紫褐色粗斑點，是兜蘭屬中罕見的種類，其兜狀花大而色艷，姿態優雅，氣味芳香，花期較長，具有較高的觀賞價值。巨瓣兜蘭被國際公約列為一級保護物種，是我國特有的備受國際關注的國家一級保護物種，是兜蘭屬植物中的上品，是園藝栽培中不可多得的種質資源，已處于瀕危滅絕的邊緣。由于巨瓣兜蘭胚發育不完全，在自然狀態下繁殖困難，存在種子萌發率極低，成苗率低的困難；傳統的無性分株繁殖法，周期長，繁殖系數低，每年只能增殖I 3倍，常規繁殖難度大。因此如何運用植物生物促成方法快速繁殖巨瓣兜蘭已成為蘭科植物科研項目的重點。巨瓣兜蘭的組培快繁方法就是采用蘭花的無菌播種與試管快速成苗的方法，在短時間內以進行大規模種植以滿足市場需求，在其科研與開發中具有極深遠的現實意義。

發明內容
本發明的目的是開發一種巨瓣兜蘭的組培快繁方法，在專門配制的培養基上，通過人工無菌播種的方法，經過無菌播種、種子萌發、壯苗培養和試管苗移栽等繁殖步驟，獲得原球莖及芽混合體，利用無菌播種小苗進行增殖，在短時間內獲得大量整齊劃一的試管苗，通過壯苗生根培養能形成完整植株。通過發明人的努力，完成了巨瓣兜蘭的組培快繁方法的研究工作。
本發明巨瓣兜蘭的組培快繁方法，其過程包括以下步驟
(I)無菌培養物的建立，選取生長健壯的巨瓣兜蘭母株，在開花時進行人工授粉，授粉后180天，將發育至基本成熟而未開裂的果實作為外植體。(2)原球莖萌發階段選用飽滿的果實用75%的酒精浸泡30秒，置于0.1%的升汞溶液中消毒20分種，無菌水沖洗4-5次，切開果實，用接種針將褐色粉末狀胚接種到1/2MS添加α -萘乙酸(NAA) 2毫克/升上培養基上，培養60天左右，形成原球莖及芽。(3)增殖培養階段為獲得更多的種苗，將芽和原球莖混合組織接種在1/2MS附加6-芐基氨基嘌呤出-BA) 20毫克/升培養基上，經120天培養，長成叢生帶短根的小苗。(4)壯苗生根階段將長成的叢生植株分開，接種到1/4MS添加吲哚乙酸(IBA)O. 4毫克/升的培養基上，培養90天后長成具2-3條根、3-4片葉的完整植株。(5)練苗及移栽當試管苗長至3-4厘米時，出瓶前在溫室中的自然光照下煉苗7·天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養基，移入碎樹皮和水苔的混合基質中。溫室保持15-28°C的溫度、70%以上的濕度、78-80%的遮陰并通風，巨瓣兜蘭即可正常生長，成苗的移栽成活率可達90%以上。通常15天左右澆一次有機肥(發酵的油枯水)或葉面肥，其濃度為稀釋1000倍質量比，薄肥勤施，加強病蟲害管護措施即可建立巨瓣兜蘭種苗的產業化培育方法體系。本發明的有益效果是這項發明的巨瓣兜蘭的組培繁殖方法，可以提高繁殖系數，是獲得大量巨瓣兜蘭種苗的高效率試管繁殖方法，具有萌發率高，成苗快，種苗品質好、生長勢強等優勢，能夠得到整齊化一的種苗，并在短時間內提供大量的種苗，為蘭花的種苗生產提供一條有效的途徑，從而更好的保護野生資源。
具體實施例方式實施例I
(I)無菌培養物的建立，選擇發育基本成熟而未開裂的果實作為外植體，進行無菌培養。(2)原球莖萌發階段選用飽滿的果實用75%的酒精浸泡30秒，置于0.1%的升汞溶液中消毒20分種，無菌水沖洗4-5次，切開果實，用接種針將褐色粉末狀胚接種到1/2MS添加α -萘乙酸(NAA) 2毫克/升的培養基上，培養60天左右，形成原球莖及芽。(3)增殖培養階段為獲得更多的種苗，將芽和原球莖混合組織接種在1/2MS附加6-芐基氨基嘌呤出-BA) 20毫克/升培養基上，經120天培養，長成叢生帶短根的小苗，繁殖系數可達3-4。(4)壯苗生根階段將叢生植株分開，接種到1/4MS添加吲哚乙酸(IBA) O. 4毫克/升的培養基上，培養90天后可長成具2-3條根、3-4片葉的完整植株。(5)練苗及移栽當試管苗長至3-4厘米時，出瓶前在溫室中的自然光照下煉苗7天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養基，移入碎樹皮和水苔的混合基質中。溫室保持15-28°C的溫度、70%以上的濕度、78-80%的遮陰并通風，巨瓣兜蘭即可正常生長，成苗的移栽成活率可達90%以上。通常15天左右澆一次有機肥(發酵的油枯水)或葉面肥(稀釋1000倍)，薄肥勤施，加強病蟲害管護措施即可建立巨瓣兜蘭種苗的產業化培育方法體系，目前栽種巨瓣兜蘭種苗3000余株。
權利要求
1.巨瓣兜蘭的組培快繁方法，其特征是方法包括以下步驟 ①無菌培養物的建立，選取生長健壯的巨瓣兜蘭母株，在開花時進行人工授粉，授粉后180天，將發育至基本成熟而未開裂的果實作為外植體； ②原球莖萌發階段選用飽滿的果實用75%的酒精浸泡30秒，置于O.1%的升汞溶液中消毒20分種，無菌水沖洗4-5次，切開果實，用接種針將褐色粉末狀胚接種到1/2MS添加α -萘乙酸(NAA) 2毫克/升上培養基上，培養60天左右，形成原球莖及芽； ③增殖培養階段為獲得更多的種苗，將芽和原球莖混合組織接種在1/2MS附加6-芐基氨基嘌呤出-BA) 20毫克/升培養基上，經120天培養，長成叢生帶短根的小苗； ④壯苗生根階段將長成的叢生植株分開，接種到1/4MS添加吲哚乙酸(IBA)O. 4毫克/升的培養基上，培養90天后長成具2-3條根、3-4片葉的完整植株； ⑤練苗及移栽當試管苗長至3-4厘米時，出瓶前在溫室中的自然光照下煉苗7天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養基，移入碎樹皮和水苔的混合基質中；溫室保持15-28°C的溫度、70%以上的濕度、78-80%的遮陰并通風，巨瓣兜蘭即可正常生長，成苗的移栽成活率可達90%以上；通常15天左右澆一次有機肥(發酵的油枯水)或葉面肥其濃度為稀釋1000倍質量比，薄肥勤施，加強病蟲害管護措施即可建立巨瓣兜蘭種苗的產業化培育方法。
全文摘要
本發明公開了巨瓣兜蘭組培快繁方法，方法包括以下步驟(1)外植體的建立，(2)原球莖萌發階段，(3)增殖培養階段，(4)壯苗生根階段和(5)練苗及移栽；當巨瓣兜蘭試管苗長至3-4厘米時，移栽前在溫室中自然光照下煉苗10天左右后，溫室保持15-25℃的溫度、70%以上的濕度、78-80%的遮陰并通風，巨瓣兜蘭即可正常生長，種苗的移栽成活率可達93％以上；本發明的有益效果是通過巨瓣兜蘭組培快繁方法，可大大提高種苗的繁殖系數，獲得品相高度一致的種苗，便于大規模的工廠化種植；對蘭科植物研究和開發，注意對選用品種具體屬性研究，選用具體方法，這在珍稀植物的保護開發及可持續利用方面具有十分重要的意義。
文檔編號A01H4/00GK102884980SQ20121034362
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者王蓮輝, 姜運力, 潘德權, 馮育才, 李叢瑞 申請人:貴州省林業科學研究院