專利名稱：蕙蘭雜交育種的方法
技術領域：
本發明涉及中國蘭花的育種領域，具體地說是一種蕙蘭雜交育種的方法。
背景技術：
蕙蘭(Cymbidium faberi)是中國栽培歷史最久和最普及的蘭花之一,為我國二級重點保護野生物種。隨著各國經濟的發展和生活水平的提高，國民對蘭花的需求也日益增加。美國、荷蘭、日本、韓國等國家相繼通過各種技術措施大力發展蘭花產業，培育出觀賞價值高的品種，帶動了經濟增長。我國的蕙蘭主要集中在南方地區，以挖掘野生蘭花資源，并依靠傳統的分株方式進行繁殖；我國北方地區蕙蘭資源少，傳統分株方式繁殖慢，新品種的繁育速度大大落后于其他國家。通過人工雜交以及組織培養的方式可以大大加快蕙蘭繁殖速度，是加快蘭花產業化生產的重要途徑之一。

發明內容
為解決上述存在的技術問題，本發明提供了一種蕙蘭雜交育種的方法，根據蕙蘭不同生長階段所需要的生長條件，分階段解決雜交授粉、果實消毒、原球莖誘導、根狀莖增殖、根狀莖分化、生根壯苗、幼苗移栽等技術問題，簡單高效，易于產業化生產。為達到上述目的，本發明采用的技術方案如下
本蕙蘭雜交育種的方法，通過如下步驟實現
(1)雜交授粉選擇開放4-7天的蕙蘭植株作為母本，取當天開花的蕙蘭植株作為父本，取下父本和母本藥帽中的花粉，將父本的花粉放入母本蕊柱先端下側的蕊腔中，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去，掛牌注明授粉組合和授粉時間，授粉后遮光75%，24 26°C條件下生長，待人工授粉5 6個月，子房膨大明顯；
(2)無菌播種蒴果尚未完全成熟時，將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，陰涼處晾干果實表面水分后，將其放入冰箱低溫冷藏處理2 3天，處理后的果實用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次，取出其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上，并將其置于23 27°C下暗培養，種胚開始萌發，所述誘導原球莖的培養基為Bn、I. O I. 5mg/LNAA、l. O 2. O mg/L6_BA、100 150mg/L 椰汁、20 30g/L 蔗糖、6 8g/L瓊脂和I. 5 3g/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. I ;
(3)根狀莖增殖將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中繼續繁殖，所述根狀莖增殖培養基為 MS、0.5 I. 5mg/L ΝΑΑ,Ο. I O. 5mg/L 6-BAU. 5 2.0g/L 蛋白胨、20 30g/L蔗糖、6 8g/L瓊脂和I. 5 3g/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的增殖培養基放置在光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養，根狀莖快速增殖，繼續將增殖后的根狀莖進行幾次繼代培養，得到一定的規模；
(4)不定芽誘導將增殖后得到的根狀莖接到分化培養基上，使其分化出不定芽，所述分化培養基為 H、L0 2. 0mg/LNAA,2. O 5. 0mg/L6-BA,20 30g/L 蔗糖、6 8g/L瓊脂和100 120g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的分化培養基放置在光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養；
(5)生根壯苗當不定芽高度增長到45cm時將其轉移到生根壯苗培養基中，所述生根壯苗培養基為 1/2MS、0. 5 2.0mg/LNAA、20 30g/L 蔗糖、6 8g/L 瓊脂和 I. 5 3g/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的生根壯苗培養基置于光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養；
(6)煉苗移栽當幼苗生長到IOcm以上，根多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中3 7天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長2 5天，即可將其從培養瓶中取出移栽，將組培苗取出移栽時，用甲基托布津溶液I. 10% I. 15%浸泡半小時左右，置于營養杯中，用腐殖三年以上的質量比為松針仙土 草炭椰殼麥飯石=15%:15%:15%:25%:30%的混合物作為基質填埋；將幼苗上盆之后，放到溫室大棚中，保證通風、空氣濕度70 80 %、光線1500 20001x的調控，定期噴施抗菌劑咯菌晴、甲基托布津或苯醚甲環唑，預防病蟲害，根據基質的含水量情況來決定噴水量。
優選的，所述的誘導原球莖的培養基為Bn、l. Omg/LNAAU. O mg/L6_BA、100mg/L椰汁、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂和2g/L活性炭的混合物，PH=5. 5。優選的，所述根狀莖增殖培養基為MS、I. Omg/L ΝΑΑ、0· 5mg/L 6-BA、I. 5g/L蛋白胨、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂和2g/L活性炭的混合物，PH=5. 5。優選的，所述分化培養基為H、I. 0mg/LNAA、4. 0mg/L6_BA、25g/L蔗糖、7g/L瓊脂和100g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 5。優選的，所述生根壯苗培養基為1/2MS、I. 0mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂和2g/L活性炭的混合物，PH=5. 5。本發明針對蕙蘭不同的生長階段選擇出適合的培養基組分，以達到最高效的培養效果，節省了成本又提高了成活率，瓶苗的成活率達到94%以上，年生長量達8 — 10cm，大大降低了產業化生產育苗周期，另外，對于果實采用75%酒精殺毒消菌即可達到很好的效果，污染率低，減少了升汞等其他藥劑對蒴果的藥害作用，操作簡單，有利于環保。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細描述
本發明所闡述的蕙蘭雜交育種的方法，通過如下步驟實現
(I)雜交授粉選擇開放4 7天的蕙蘭植株作為母本，取當天開花的蕙蘭植株作為父本，取下父本和母本藥帽中的花粉，將父本的花粉放入母本蕊柱先端下側的蕊腔中。為防止昆蟲的再次授粉，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去，掛牌注明授粉組合和授粉時間。授粉后遮光75%，24 26°C條件下生長，待人工授粉5 6個月，子房膨大明顯。(2)無菌播種蒴果尚未完全成熟時，將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，陰涼處晾干果實表面水分后，將其放入冰箱低溫冷藏處理2 3天，處理后的果實用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次，將處理好的果實放入已經滅菌處理帶有濾紙的培養皿中，令果實上面的水分被充分吸收。用高溫滅菌過刀片沿著果實的棱將其縱切，用鑷子將其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上。并將其置于23 27°C下暗培養，種胚開始萌發，出現白色的原球莖，繼續培養。所述誘導原球莖的培養基為Bn、l. O I. 5mg/L NAAU. O 2. O mg/L 6-BAU00 150mg/L 椰汁、20 30g/L 蔗糖、6 8g/L 瓊脂和I. 5 3g/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. I。(3)根狀莖增殖出現大量的白色原球莖之后，將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中繼續繁殖，增大品種規模。所述根狀莖增殖培養基為MS、0. 5 I. 5mg/L NAA,
O.I O. 5mg/L 6-BAU. 5 2.0g/L 蛋白胨、20 30g/L蔗糖、6 88/1瓊脂和1.5 3. Og/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的增殖培養基放置在光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養，根狀莖快速增殖，根狀莖既多又壯綠，達到分瓶的效果，繼續將增殖后的根狀莖進行幾次繼代培養，得到一定的規模。其中B11、H和MS是基本培養基，NAA為α -萘乙酸，6-ΒΑ為6_芐氨基腺嘌呤，下文不再贅述。(4)不定芽誘導將增殖后得到的根狀莖接到分化培養基上，使其分化出不定芽，所述分化培養基為 Η、1· O 2. 0mg/LNAA、2. O 5. 0mg/L6_BA、20 30g/L 蔗糖、6 8g/L瓊脂和100 120g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的分化培養基放置在光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養，分化培養基中相繼分化 出不定芽。(5)生根壯苗當不定芽高度增長到4_5cm時將其轉移到生根壯苗培養基中，所述生根壯苗培養基為1/2MS、0. 5 2.0mg/LNAA、20 30g/L蔗糖、6 8g/L瓊脂和I. 5 3. Og/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的生根壯苗培養基置于光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養，讓其分化出根的同時使葉片更加強壯，使之為適應溫室環境打下基礎。(6)煉苗移栽當幼苗生長到IOcm以上，根多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中3 7天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長2 5天，即可將其從培養瓶中取出移栽，將組培苗取出移栽時，用甲基托布津溶液1.12% I. 15%浸泡40 60分鐘，置于營養杯中，用腐殖三年以上的質量比為松針仙土草炭椰殼麥飯石=15%: 15%: 15%: 25%: 30%的混合物作為基質填埋，幼苗不可埋的太深，將根部蓋起后，添加薄層基質即可。將幼苗上盆之后，放到溫室大棚中，保證通風、空氣濕度70% 80 %、光線1500 20001x的調控，定期噴施抗菌劑咯菌晴、甲基托布津或苯醚甲環唑，預防病蟲害，根據基質的含水量情況來決定噴水量。可使瓶苗的成活率達到94%，年生長量達8 IOcm0實施例I:
蕙蘭(新極品X元字)的雜交授粉、種子萌發以及快速繁育幼苗的方法
(I)雜交授粉取開花的蕙蘭品種新極品與元字，取開放4天的蕙蘭植株作母本，取當天開花的新極品確定為父本，分別取下兩株中成熟花朵的藥帽中的花粉塊，把父本的花粉塊牢牢粘在母本蕊柱先端下側的蕊腔中，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去。授粉后掛上標簽，注明授粉組合，授粉時間。24°C條件下生長，人工授粉5個月時子房膨大明顯，結實率90%。(2)無菌播種蒴果尚未完全成熟時，將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，晾干后將其放入冰箱中進行低溫冷藏處理3天。用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次。將其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上，置于23°C下暗培養。誘導原球莖的培養基為Bn、l. Omg/L NAAU.O mg/L 6-BAU00mg/L椰汁、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂和2g/L活性炭的混合物，PH=5. 4，培養2個月種胚萌發。
(3)根狀莖增殖將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中，讓其繼續繁殖。根狀莖增殖培養基為MS、0. 5mg/L NAA、0. 2mg/L 6-BAU. 5g/L蛋白胨、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂和2g/L活性炭的混合物，PH=5. 6。將處理好的增殖培養基放置在光照15001x，溫度25°C，12h/d光照的無菌室中培養。增殖率達到310%。(4)不定芽誘導增殖2個月即可得到一定規模的根狀莖，將其接到分化培養基上，使其分化出不定芽。分化培養基為H、I. 0mg/LNAA、2. 0mg/L6_BA、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂和100g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 4。將處理好的分化培養基放置在光照15001x，溫度24°C，13h/d光照的無菌室中培養。分化率達到85%。(5)生根壯苗誘導3個月之后，分化出大量高低不等不定芽，一部分分化出不定根。將高4cm的不定芽接種的生根壯苗培養中，讓其分化出不定根，使葉片生長更壯，生根率為100%。生根壯苗培養基為1/2MS、I. 0mg/LNAA、20g/L蔗糖、8g/L瓊脂和2g/L活性炭的混合物，PH=5. 5。將處理好的生根壯苗培養基置于光照15001x、溫度23°C、12h/d光照的無
菌室中培養。 (6)煉苗移栽當幼苗生長到10cm，根有多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中4天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長3天，即可將其從培養瓶中取出移栽。用I. 10%甲基托布津溶液侵泡40分鐘,置于營養杯中,用腐殖三年以上松針仙土 草炭椰殼麥飯石=15% :15% 15% 25% 30%的基質填埋，將根部恰好填埋之后再添加薄層基質即可，不可埋得太深。將幼苗上盆之后，放到特定環境的溫室大棚中，保證通風、空氣濕度75%、光線15001x的調控，定期噴施抗菌劑百菌清或甲基托布津，預防病蟲害，定期施肥(花寶5號、KH2PO4)根據基質的含水量情況來決定噴水量。瓶苗的成活率達到95%。實施例2:
蕙蘭(老極品X新上海)的雜交授粉、種子萌發以及快速繁育幼苗的方法
(O雜交授粉取開花的蕙蘭品種老極品與新上海，取開放6天的新上海植株作母本，取當天開花的老極品確定為父本，分別取下兩株中成熟花朵的藥帽中的花粉塊，把父本的花粉塊牢牢粘在母本蕊柱先端下側的蕊腔中，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去。授粉后掛上標簽，注明授粉組合，授粉時間。26°C條件下生長，人工授粉6個月時子房膨大明顯，結實率 100%。(2)無菌播種蒴果尚未完全成熟時，將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，晾干后將其放入冰箱中進行低溫冷藏處理3天。用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次。將其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上，置于27°C下暗培養。誘導原球莖的培養基為 Bn、1.2mg/L NAAU.5 mg/L 6_BA、120mg/L 椰汁、25g/L 蔗糖、8g/L 瓊脂和I. 5g/L活性炭的混合物，PH=5. 5，培養40天種胚萌發。(3)根狀莖增殖將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中，讓其繼續繁殖。根狀莖增殖培養基為MS、I. 5mg/L NAA、0. 3mg/L 6-BAU. 7g/L蛋白胨、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂和3g/L活性炭的混合物，PH=5. 4。將處理好的增殖培養基放置在光照17001x，溫度24°C，14h/d光照的無菌室中培養。增殖率達到280%。(4)不定芽誘導增殖2個月即可得到一定規模的根狀莖，將其接到分化培養基上，使其分化出不定芽。分化培養基為H、I. 5mg/LNAA、5. 0mg/L6_BA、25g/L蔗糖、6g/L瓊脂和120g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 6。將處理好的分化培養基放置在光照17001x，溫度25°C，12h/d光照的無菌室中培養。分化率達到90%。(5)生根壯苗誘導3個月之后，分化出大量高低不等不定芽，一部分分化出不定根。將高5cm的不定芽接種的生根壯苗培養中，讓其分化出不定根，使葉片生長更壯，生根率為95%。生根壯苗培養基為1/2MS、2. 0mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂和3g/L活性炭的混合物，PH=5. 6。將處理好的生根壯苗培養基置于光照20001x、溫度27°C、14h/d光照的無
菌室中培養。(6)煉苗移栽當幼苗生長到10cm，根有多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中5天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長5天，即可·將其從培養瓶中取出移栽。用I. 13%甲基托布津溶液侵泡30分鐘,置于營養杯中,用腐殖三年以上松針仙土 草炭椰殼麥飯石=15% 15% 15% 25% 30%的基質填埋，將根部恰好填埋之后再添加薄層基質即可，不可埋得太深。將幼苗上盆之后，放到特定環境的溫室大棚中，保證通風、空氣濕度70%、光線20001x等的調控，定期噴施抗菌劑咯菌晴或甲基托布津，預防病蟲害，定期施肥(花寶5號、KH2PO4)根據基質的含水量情況來決定噴水量。瓶苗的成活率達到90%。實施例3:
蕙蘭(新上海X大一品)的雜交授粉、種子萌發以及快速繁育幼苗的方法
(I)雜交授粉取開花的蕙蘭品種新上海與大一品，取開放7天的蕙蘭大一品做母本，取當天開花的新上海確定為父本，分別取下兩株中成熟花朵的藥帽中的花粉塊，把父本的花粉塊牢牢粘在母本蕊柱先端下側的蕊腔中，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去。授粉后掛上標簽，注明授粉組合，授粉時間。25°C條件下生長，人工授粉160天時子房膨大明顯，結實率 95%。(2)無菌播種將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，晾干后將其放入冰箱中進行低溫冷藏處理3天。用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次。將其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上，置于25°C下暗培養。誘導原球莖的培養基為Bn、
I.5mg/L NAA>2. O mg/L 6_BA、130mg/L 椰汁、30g/L 鹿糖、6g/L 瓊脂和 3g/L 活性炭的混合物，PH=5. 6，培養50天種胚萌發。(3)根狀莖增殖將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中，讓其繼續繁殖。根狀莖增殖培養基為MS、I. Omg/L NAA、0. 5mg/L 6-BA,2. Og/L蛋白胨、25g/L蔗糖、8g/L瓊脂和I. 5g/L活性炭的混合物，PH=5. 5。將處理好的增殖培養基放置在光照20001x，溫度23°C，13h/d光照的無菌室中培養。增殖率達到300%。(4)不定芽誘導增殖2個月即可得到一定規模的根狀莖，將其接到分化培養基上，使其分化出不定芽。分化培養基為H、2. 0mg/LNAA、3. 0mg/L6_BA、30g/L蔗糖、8g/L瓊脂和110g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 5。將處理好的分化培養基放置在光照20001x，溫度23°C，14h/d光照的無菌室中培養。分化率達到80%。(5)生根壯苗誘導2個月之后，分化出大量高低不等不定芽，一部分分化出不定根。將高4cm以上的不定芽接種的生根壯苗培養中，讓其分化出不定根，使葉片生長更壯，生根率為88%。生根壯苗培養基為1/2MS、0. 5mg/LNAA、25g/L蔗糖、7g/L瓊脂和I. 5g/L活性炭的混合物，PH=5. 6。將處理好的生根壯苗培養基置于光照18001x、溫度25°C、13h/d光照的無菌室中培養。(6)煉苗移栽當幼苗生長到10cm，根有多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中7天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長2天，即可將其從培養瓶中取出移栽。用I. 15%甲基托布津溶液侵泡20分鐘,置于營養杯中,用腐殖三年以上松針仙土 草炭椰殼麥飯石=15% :15% 15% 25% 30%的基質填埋，將根部恰好填埋之后再添加薄層基質即可，不可埋得太深。將幼苗上盆之后，放到特定環境的溫室大棚中，保證通風、空氣濕度70%、光線18001x等的調控，定期噴施抗菌劑百菌清或咯菌晴，預防病蟲害，定期施肥(花寶5號、KH2PO4)根據基質的含水量情況來決定噴水量。瓶苗的成活率達到92%。實施例4:
蕙蘭(大一品X元字)的雜交授粉、種子萌發以及快速繁育幼苗的方法
(I)雜交授粉取開花的蕙蘭品種大一品與元字，取開放5天的蕙蘭元字植株作母本， 取當天開花的大一品確定為父本，分別取下兩株中成熟花朵的藥帽中的花粉塊，把父本的花粉塊牢牢粘在母本蕊柱先端下側的蕊腔中，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去。授粉后掛上標簽，注明授粉組合，授粉時間。25°C條件下生長，人工授粉165天時子房膨大明顯，結實率 100%。(2)無菌播種將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，晾干后將其放入冰箱中進行低溫冷藏處理2天。用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次。將其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上，置于25°C下暗培養。誘導原球莖的培養基為Bn、
I.3mg/L ΝΑΑ、1·5 mg/L 6_BA、150mg/L 椰汁、20g/L 鹿糖、8g/L 瓊脂和 2. 5g/L 活性炭的混合物，PH=5. 5，培養2個月種胚萌發。(3)根狀莖增殖將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中，讓其繼續繁殖。根狀莖增殖培養基為MS、1.5mg/L NAA,O. lmg/L 6_BA、2. Og/L蛋白胨、25g/L蔗糖、6g/L瓊脂和2. 5g/L活性炭的混合物，PH=5. 6。將處理好的增殖培養基放置在光照18001x，溫度27°C，13h/d光照的無菌室中培養。增殖率達到280%。(4)不定芽誘導增殖2個月即可得到一定規模的根狀莖，將其接到分化培養基上，使其分化出不定芽。分化培養基為H、I. 5mg/LNAA、4. 0mg/L6_BA、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂和120g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 6。將處理好的分化培養基放置在光照18001x，溫度27°C，12h/d光照的無菌室中培養。分化率達到90%。(5)生根壯苗誘導2個月之后，分化出大量高低不等不定芽，一部分分化出不定根。將高5cm以上的不定芽接種的生根壯苗培養中，讓其分化出不定根，使葉片生長更壯，生根率為90%。生根壯苗培養基為1/2MS、1. 5mg/LNAA、20g/L蔗糖、6g/L瓊脂和2. 5g/L活性炭的混合物，PH=5. 4。將處理好的生根壯苗培養基置于光照18001x、溫度25°C、13h/d光照的無菌室中培養。(6)煉苗移栽當幼苗生長到10cm，根有多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中3天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長4天，即可將其從培養瓶中取出移栽。用I. 12%甲基托布津溶液侵泡30分鐘,置于營養杯中,用腐殖三年以上松針仙土 草炭椰殼麥飯石=15% :15% 15% 25% 30%的基質填埋，將根部恰好填埋之后再添加薄層基質即可，不可埋得太深。將幼苗上盆之后，放到特定環境的溫室大棚中，保證通風、空氣濕度80%、光線ISOOIx的調控，定期噴施抗菌劑甲基托布津，預防病蟲害，定期施肥(花寶5號、KH2PO4)根據基質的含水量情況來決定噴水量。瓶苗的成活率達到95%。實施例5:
蕙蘭(新極品X溫州素)的雜交授粉、種子萌發以及快速繁育幼苗的方法
(I)雜交授粉取開花的蕙蘭品種新極品與溫州素，取開放6天的蕙蘭溫州素植株作母本，取當天開花的新極品確定為父本，分別取下兩株中成熟花朵的藥帽中的花粉塊，把父本的花粉塊牢牢粘在母本蕊柱先端下側的蕊腔中，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去。授粉后掛上標簽，注明授粉組合，授粉時間。25°C條件下生長，人工授粉6個月時子房膨大明顯，結實率90%。(2)無菌播種將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，晾干后將其放入冰箱中進行低溫冷藏處理3天。用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次。將 其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上，置于25°C下暗培養。誘導原球莖的培養基為Bn、
I.4mg/L ΝΑΑ、1· O mg/L 6_BA、140mg/L 椰汁、30g/L 鹿糖、7g/L 瓊脂和 2. Og/L 活性炭的混合物，PH=5. 5，培養70天種胚萌發。(3)根狀莖增殖將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中，讓其繼續繁殖。根狀莖增殖培養基為MS、I. 5mg/L NAA、0. 4mg/L 6-BAU. 8g/L蛋白胨、30g/L蔗糖、8g/L瓊脂和2. Og/L活性炭的混合物，PH=5. 5。將處理好的增殖培養基放置在光照20001x，溫度23°C，12h/d光照的無菌室中培養。增殖率達到300%。(4)不定芽誘導增殖2個月即可得到一定規模的根狀莖，將其接到分化培養基上，使其分化出不定芽。分化培養基為H、I. 0mg/LNAA、5. 0mg/L6_BA、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂和100g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 5。將處理好的分化培養基放置在光照20001x，溫度25°C，12h/d光照的無菌室中培養。分化率達到80%。(5)生根壯苗誘導三個月之后，分化出大量高低不等不定芽，一部分分化出不定根。將高4cm以上的不定芽接種的生根壯苗培養中，讓其分化出不定根，使葉片生長更壯，生根率為95%。生根壯苗培養基為1/2MS、1. 0mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂和2. Og/L活性炭的混合物，PH=5. 5。將處理好的生根壯苗培養基置于光照18001x、溫度25°C、13h/d光照的無菌室中培養。(6)煉苗移栽當幼苗生長到10cm，根有多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中4天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長2天，即可將其從培養瓶中取出移栽。用I. 10%甲基托布津溶液侵泡30分鐘,置于營養杯中,用腐殖三年以上松針仙土 草炭椰殼麥飯石=15% 15% 15% 25% 30%的基質填埋，將根部恰好填埋之后再添加薄層基質即可，不可埋得太深。將幼苗上盆之后，放到特定環境的溫室大棚中，保證通風、空氣濕度75%、光線20001x的調控，定期噴施抗菌劑甲基托布津或預防病蟲害，定期施肥(花寶5號、KH2PO4)根據基質的含水量情況來決定噴水量。瓶苗的成活率達到 95%。當然，上述說明并非是對本發明的限制，本發明也并不僅限于上述舉例，本技術領域的技術人員在本發明的實質范圍內所做出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種蕙蘭雜交育種的方法，其特征在于，通過如下步驟實現 (1)雜交授粉選擇開放4-7天的蕙蘭植株作為母本，取當天開花的蕙蘭植株作為父本，取下父本和母本藥帽中的花粉，將父本的花粉放入母本蕊柱先端下側的蕊腔中，將授粉過的花朵唇瓣從基部除去，掛牌注明授粉組合和授粉時間，授粉后遮光75%，24 26°C條件下生長，待人工授粉5 6個月，子房膨大明顯； (2)無菌播種蒴果尚未完全成熟時，將果實從果柄基部剪下，清洗果實表面，陰涼處晾干果實表面水分后，將其放入冰箱低溫冷藏處理2 3天，處理后的果實用75%的酒精進行表面消毒殺菌10分鐘，再用無菌水沖洗3次，取出其種胚播撒在誘導原球莖的培養基上，并將其置于23 27°C下暗培養，種胚開始萌發，所述誘導原球莖的培養基為Bn、I. O I. 5mg/LNAA、l. O 2. O mg/L6_BA、100 150mg/L 椰汁、20 30g/L 蔗糖、6 8g/L瓊脂和I. 5 3g/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. I ; (3)根狀莖增殖將萌發的原球莖轉移到根狀莖增殖培養基中繼續繁殖，所述根狀莖增殖培養基為 MS、0.5 I. 5mg/L ΝΑΑ,Ο. I O. 5mg/L 6-BAU. 5 2.0g/L 蛋白胨、20 30g/L蔗糖、6 8g/L瓊脂和I. 5 3g/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的增殖培養基放置在光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養，根狀莖快速增殖，繼續將增殖后的根狀莖進行幾次繼代培養，得到一定的規模； (4)不定芽誘導將增殖后得到的根狀莖接到分化培養基上，使其分化出不定芽，所述分化培養基為 H、L0 2. 0mg/LNAA,2. O 5. 0mg/L6-BA,20 30g/L 蔗糖、6 8g/L瓊脂和100 120g/L香蕉泥的混合物，PH=5. 5±0. I，將處理好的分化培養基放置在光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養； (5)生根壯苗當不定芽高度增長到45cm時將其轉移到生根壯苗培養基中，所述生根壯苗培養基為 1/2MS、0. 5 2.0mg/LNAA、20 30g/L 蔗糖、6 8g/L 瓊脂和 I. 5 3g/L活性炭的混合物，PH=5. 5±0. 1，將處理好的生根壯苗培養基置于光照1500 20001x、溫度23 27°C、12 14h/d光照的無菌室中培養； (6)煉苗移栽當幼苗生長到IOcm以上，根多于3條時，將組培瓶從無菌培養室中取出，封口放置溫室中3 7天，之后將組培瓶打開，讓瓶中的組培苗暴露在空氣中生長2 5天，即可將其從培養瓶中取出移栽，將組培苗取出移栽時，用甲基托布津溶液I. 10% I. 15%浸泡20 40分鐘，置于營養杯中，用腐殖三年以上的質量比為松針仙土 草炭椰殼麥飯石=15%:15%:15%:25%:30%的混合物作為基質填埋；將幼苗上盆之后，放到溫室大棚中，保證通風、空氣濕度70 80 %、光線1500 20001x的調控，定期噴施抗菌劑咯菌晴、甲基托布津或苯醚甲環唑，預防病蟲害，根據基質的含水量情況來決定噴水量。
2.根據權利要求I所述的蕙蘭雜交育種的方法，其特征在于，所述的誘導原球莖的培養基為 Bn、l. Omg/LNAA、I. O mg/L6_BA、100mg/L 椰汁、20g/L 蔗糖、7g/L 瓊脂和 2g/L 活性炭的混合物，PH=5. 5。
3.根據權利要求I所述的蕙蘭雜交育種的方法，其特征在于，所述根狀莖增殖培養基為 MS、I. Omg/L ΝΑΑ、0· 5mg/L 6_BA、1. 5g/L 蛋白胨、20g/L 蔗糖、7g/L 瓊脂和 2g/L 活性炭的混合物，PH=5. 5。
4.根據權利要求I所述的蕙蘭雜交育種的方法，其特征在于，所述分化培養基為H、I.Omg/LNAA>4. 0mg/L6_BA、25g/L 鹿糖、7g/L 瓊脂和 100g/L 香蕉泥的混合物，PH=5. 5。
5.根據權利要求I所述的蕙蘭雜交育種的方法，其特征在于，所述生根壯苗培養基為1/2MS、1. Omg/LNAA、30g/L 蔗糖、7g/L 瓊脂和 2g/L 活性炭的混合物，PH=5. 5。
全文摘要
本發明公開了一種蕙蘭雜交育種的方法，涉及中國蘭花的育種領域，針對蕙蘭不同的生長階段選擇出適合的培養基組分，以達到最高效的培養效果，節省了成本又提高了成活率，瓶苗的成活率達到94%以上，年生長量達8—10cm，大大降低了產業化生產育苗周期，另外，對于果實采用75%酒精殺毒消菌即可達到很好的效果，污染率低，減少了升汞等其他藥劑對蒴果的藥害作用，操作簡單，有利于環保。
文檔編號A01H4/00GK102893871SQ20121040872
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者王長憲, 李承秀, 王厚新, 王峰, 孫忠奎, 孫芳, 王鄭昊, 張 林, 杜輝, 王傳光 申請人:泰安市泰山林業科學研究院