一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，該方法包括以下步驟：⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基；⑵制備種子培養(yǎng)基；⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基；⑷杯珊瑚菌菌絲接種至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基，經(jīng)恒溫培養(yǎng)得菌絲體；⑸菌絲體接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)振蕩培養(yǎng)得菌種種子液；⑹菌種種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)振蕩培養(yǎng)得發(fā)酵液；發(fā)酵液離心、洗滌、烘干、磨粉后，得到菌絲體干粉末；⑺菌絲體干粉末先超聲提取再浸提得到多糖浸提液；⑻多糖浸提液離心、過濾、濃縮后得到多糖濃縮液；⑼多糖濃縮液加Sevag試劑離心后得多糖提取液；⑽多糖提取液脫色后得多糖流出液；⑾多糖流出液加乙醇靜置，得沉淀物；⑿離心干燥即得多糖干品。本發(fā)明操作簡單，成本低，多糖得率高。
【專利說明】一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及真菌多糖【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隴南康縣地處西秦嶺南側(cè)隴南山中，最高海拔2483m，最低海拔560m，垂直高差較大，具有明顯的立體氣候特點(diǎn)。復(fù)雜的地形、氣候環(huán)境，造就了該地區(qū)亞熱帶向暖溫帶過渡氣候，溫和濕潤，雨量充沛，自然資源十分豐富，擁有高等植物172科1000余種，活立木蓄積量800多萬立方米，森林覆蓋率高達(dá)60%以上，國家和省列珍貴樹種28種，天麻、杜仲等野生藥材576種，各種菌類96種，尤其是大型真菌中的珊瑚菌類。杯珊瑚菌，別名杯冠瑚菌，屬非褶菌目、珊瑚菌科、杯珊瑚菌屬，近白色或淡黃色、淺粉紅色，柄纖細(xì)，頂端杯狀。在我國主要分布于吉林、河北、河南、湖南、福建、陜西、四川、甘肅等省。杯珊瑚菌是我國珍貴的野生食用菌資源，具有很高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值。杯珊瑚菌多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫功能等多種生理活性。目前對(duì)杯珊瑚菌多糖的提取研究領(lǐng)域基本空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、成本低、多糖得率高的杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法。
[0004]為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg瓊脂，使其pH值為6.0-8.0,在9(Tl00°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121 °C的條件下滅菌20min即得；
⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在9(T10(TC溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得；
⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在90-100C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得；
⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)杯珊瑚菌菌絲至所述馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4-10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體；
(5)接一環(huán)所述活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL所述種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4~10天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液；(6)將所述菌種種子液按5~20%的接種量接種至含有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4-1Ο天，即得發(fā)酵液；所述發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；所述菌絲體用蒸懼水洗滌后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末；所述發(fā)酵培養(yǎng)基在所述搖瓶中的裝瓶量為10-30% ；
⑴在所述菌絲體干粉末中按I g:10 mL~30mL的料液比加入去離子水，在功率為10(T300W的條件下超聲提取1(T30 min后，在溫度為8(T95°C的條件下浸提次數(shù)I~3次，每次llh，合并提取液，得到多糖浸提液；
⑶將所述多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心l(T20min過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為60°C、真空度為0.06、.08MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/5~1/3，得到多糖濃縮液；
⑶在所述多糖濃縮液中按其體積的1/4加入Sevag試劑,充分混合攪拌20min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到所述上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液；
(10)將50-l00mL所述多糖提取液以2~5 mL/min的流速通過苯乙烯系大孔弱堿性陰樹脂離子交換樹脂床進(jìn)行脫色，得到多糖流出液；
(11)在所述多糖流出液中按其體積的2~4倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A ;
(12)將所述沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000r / min離心20 min后,得到沉淀物B,該沉淀物B置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0005]所述步驟⑷中杯珊瑚菌菌絲是指采集于隴南康縣的杯珊瑚菌Artomycespyxidatus KX320SH按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的杯珊瑚菌菌絲；所述杯珊瑚菌Artomyces pyxidatus KX320SH在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2012112 (保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank的登錄號(hào)為JQ086388。
[0006]所述步驟⑶中Sevag試劑是指氯仿與正丁醇按4mL: ImL混合而成的混合液。
[0007]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明采用超聲波輔助熱水浸提法取代以往的單獨(dú)水提，利用超聲波空化產(chǎn)生的極大壓力和刺激效應(yīng)，加速了有效成分的釋放、擴(kuò)散及溶解，具有操作簡單、提取效率高、時(shí)間短、不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)且多糖得率高等優(yōu)點(diǎn)。
[0008]2、本發(fā)明整個(gè)過程中無需試劑和化學(xué)反應(yīng)，不但設(shè)備簡單，可操作性強(qiáng)，而且成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0009]實(shí)施例1 一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g瓊脂，使其pH值為6.0-8.0，在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0010]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0011]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4倍加水煮沸25min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在90°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0012]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)杯珊瑚菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體。
[0013]其中:杯珊瑚菌菌絲是指采集于隴南康縣的杯珊瑚菌pyxidatusKX320SH按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的杯珊瑚菌菌絲；杯珊瑚菌pyxidatusKX320SH在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2012112 (保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank的登錄號(hào)為JQ086388。
[0014](5)接一環(huán)活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液。
[0015](6)將菌種種子液按`5%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以100 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0016]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為10%。
[0017](7)在菌絲體干粉末中按I g:10 mL的料液比加入去離子水，在功率為100W的條件下超聲提取30 min后，在溫度為80°C的條件下浸提次數(shù)I次，每次lh，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0018]⑶將多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心IOmin過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為60°C、真空度為0.06MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/5，得到多糖濃縮液。
[0019]⑶在多糖濃縮液中按其體積的1/4加入Sevag試劑,充分混合攪拌20min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液；
其中:Sevag試劑是指氯仿與正丁醇按4mL =ImL混合而成的混合液。
[0020](IQ)將50 mL多糖提取液以2 mL/min的流速通過苯乙烯系大孔弱堿性陰樹脂離子交換樹脂床進(jìn)行脫色，得到多糖流出液。
[0021]該多糖流出液用紫外分光光度計(jì)在460 nm波長測(cè)量其比色值，并按下式計(jì)算脫水率:脫色率=[(脫色后的透色比-脫色前的透色比)/脫色后的透色比]*100%。
[0022](11)在多糖流出液中按其體積的2倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0023](12)將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,該沉淀物B置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0024]采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，并按下式計(jì)算:
粗多糖含量(mg/g菌絲干重)=粗多糖總質(zhì)量(mg)/菌絲體干粉末質(zhì)量(g)。
[0025]實(shí)施例2 —種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入IOg葡萄糖和IOg瓊脂，使其PH值為6.0-8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0026]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0027]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的6倍加水煮沸35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在100°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0028]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)杯珊瑚菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28 V恒溫培養(yǎng)10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體。
[0029]其中:杯珊瑚菌菌絲同實(shí)施例1。
[0030](5)接一環(huán)活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)10天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液。
[0031](6)將菌種種子液按20%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)10天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0032]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為30%。
[0033](7)在菌絲體干粉末中按1 g:30mL的料液比加入去離子水，在功率為300W的條件下超聲提取10 min后，在溫度為95°C的條件下浸提次數(shù)3次，每次3h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0034]⑶將多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心20min過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為60°C、真空度為0.08MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/3，得到多糖濃縮液。
[0035]⑶在多糖濃縮液中按其體積的1/4加入Sevag試劑,充分混合攪拌20min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0036]其中:Sevag試劑同實(shí)施例1。
[0037](IQ)將100 mL多糖提取液以5 mL/min的流速通過苯乙烯系大孔弱堿性陰樹脂離子交換樹脂床進(jìn)行脫色，得到多糖流出液。
[0038]該多糖流出液用紫外分光光度計(jì)在460 nm波長測(cè)量其比色值，并按實(shí)施例1中的公式計(jì)算脫水率。
[0039](11)在多糖流出液中按其體積的4倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0040](12)將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,該沉淀物B置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0041]采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，并按實(shí)施例1中的公式計(jì)算。
[0042]實(shí)施例3 —種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟:
⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g瓊脂，使其pH值為6.0-8.0，在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0043]⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B 補(bǔ)足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0044]⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的5倍加水煮沸30min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0,在95°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得。
[0045]⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)杯珊瑚菌菌絲至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28 V恒溫培養(yǎng)7天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體。
[0046]其中:杯珊瑚菌菌絲同實(shí)施例1。
[0047](5)接一環(huán)活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以150 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液。
[0048](6)將菌種種子液按12%的接種量接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以150 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7天，即得發(fā)酵液；發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；菌絲體用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末。
[0049]其中:發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶中的裝瓶量為20%。
[0050](7)在菌絲體干粉末中按I g:20mL的料液比加入去離子水，在功率為200W的條件下超聲提取20 min后，在溫度為8(T95°C的條件下浸提次數(shù)2次，每次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。[0051]⑶將多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心15min過濾后,得到上清液A，該上清液A在溫度為60°C、真空度為0.07MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/4，得到多糖濃縮液。
[0052]⑶在多糖濃縮液中按其體積的1/4加入Sevag試劑,充分混合攪拌20min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液。
[0053]其中:Sevag試劑同實(shí)施例1。
[0054](IQ)將75 mL多糖提取液以3.5 mL/min的流速通過苯乙烯系大孔弱堿性陰樹脂離子交換樹脂床進(jìn)行脫色，得到多糖流出液。
[0055]該多糖流出液用紫外分光光度計(jì)在460 nm波長測(cè)量其比色值，并按實(shí)施例1中的公式計(jì)算脫水率。
[0056](11)在多糖流出液中按其體積的3倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A。
[0057](12)將沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000 r / min離心20 min后,得到沉淀物B,
該沉淀物B置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0058]采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，并按實(shí)施例1中的公式計(jì)算。
【權(quán)利要求】
1.一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，包括以下步驟: ⑴制備馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液A，該濾液A補(bǔ)足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg瓊脂，使其pH值為6.0-8.0,在9(Tl00°C溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121 °C的條件下滅菌20min即得； ⑵制備種子培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液B，該濾液B補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在9(T10(TC溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得； ⑶制備發(fā)酵培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮切碎，按其質(zhì)量的4飛倍加水煮沸25~35min后用紗布過濾，得到濾液C，該濾液C補(bǔ)足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值為6.0-8.0，在9(T10(TC溫度下充分加熱溶解后分裝，在壓強(qiáng)為1.05Kg/cm2、溫度為121°C的條件下滅菌20min即得； ⑷真菌的發(fā)酵培養(yǎng):接一環(huán)杯珊瑚菌菌絲至所述馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)5-10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培養(yǎng)后的菌絲體； (5)接一環(huán)所述活化培養(yǎng)后的菌絲體至裝有IOmL所述種子培養(yǎng)基的試管中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)4~10天，制得pH值為5.0-7.0的菌種種子液； (6)將所述菌種種子液按5~20%的接種量接種至含有所述發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，并置于恒溫振蕩器上，在28°C條件下以10(T200 r/min的速率進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5-1Ο天，即得發(fā)酵液；所述發(fā)酵液在高速冷凍離心機(jī)中于5000r/min離心20min,得到菌絲體；所述菌絲體用蒸懼水洗滌后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌絲體干粉末；所述發(fā)酵培養(yǎng)基在所述搖瓶中的裝瓶量為10-30% ； ⑴在所述菌絲體干粉末中按I g:10 mL~30mL的料液比加入去離子水，在功率為10(T300W的條件下超聲提取1(T30 min后，在溫度為8(T95°C的條件下浸提次數(shù)I~3次，每次llh，合并提取液，得到多糖浸提液； ⑶將所述多糖浸提液在高速冷凍離心機(jī)中于4000r/min離心l(T20min過濾后，得到上清液A，該上清液A在溫度為60°C、真空度為0.06、.08MPa的條件下濃縮至原上清液A體積的1/5~1/3，得到多糖濃縮液； ⑶在所述多糖濃縮液中按其體積的1/4加入Sevag試劑,充分混合攪拌20min,再用高速冷凍離心機(jī)以5000 r/min離心20 min除掉變性蛋白質(zhì),棄去水與有機(jī)相間的蛋白變性層，收集上清液B，反復(fù)多次直到所述上清液B與有機(jī)相中間有清晰的分界面為止，視為蛋白質(zhì)除盡，即得多糖提取液； (10)將5(Tl00mL所述多糖提取液以2~5 mL/min的流速通過苯乙烯系大孔弱堿性陰樹脂離子交換樹脂床進(jìn)行脫色，得到多糖流出液； (11)在所述多糖流出液中按其體積的2~4倍加入質(zhì)量濃度為95%的乙醇，在4°C下靜置24h，得到沉淀物A; (12)將所述沉淀物A經(jīng)高速冷凍離心機(jī)以4000r / min離心20 min后,得到沉淀物B,該沉淀物B置于真空干燥箱內(nèi)，經(jīng)50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，其特征在于:所述步驟⑷中杯珊瑚菌菌絲是指采集于隴南康縣的杯珊瑚菌Artomyces pyxidatus KX320SH按常規(guī)方法經(jīng)組織分離獲得的杯珊瑚菌菌絲；所述杯珊瑚菌Ario焊cm pyxidatus KX320SH在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2012112，其分子生物學(xué)鑒定后的核酸序列提交至GenBank的登錄號(hào)為JQ086388。
3.如權(quán)利要求1所述的一種杯珊瑚菌菌絲多糖的提取方法，其特征在于:所述步驟⑶中Sevag試劑是指氯仿與正丁醇按4mL:lmL混`合而成的混合液。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK103554286SQ201310480672
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】陳朋, 嚴(yán)曉娟, 梁寧, 胡先望 申請(qǐng)人:甘肅省商業(yè)科技研究所