一種枯草芽孢桿菌lnxm37及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)LNXM37，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏日期為2013年9月9日，保藏編號為CGMCC?No.8141。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)LNXM37可用于作物秸稈降解，同時兼具抑制水稻紋枯病菌、油菜菌核病等植物病原菌的功能，從而促進水稻和油菜的生長，具有很好的應用前景。
【專利說明】一種枯草芽孢桿菌LNXM37及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物【技術領域】，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌LNXM37及其應用。
【背景技術】
[0002]作物秸桿是當今世界上僅次于煤炭，石油，天然氣的第四大能源，也是唯一可再生的能源，是最具有利用潛力的生物質資源之一。在傳統農業中，秸桿資源不經過任何處理而直接用于肥料、燃料和飼料，利用率較低，并且大量的秸桿由于缺乏合適利用方法而被農民就地焚燒，一方面是對資源的一種浪費，另一方面，給周邊地區安全和環境帶來了巨大威脅，如釋放出大量一氧化碳、氮氧化物、光化學氧化劑和懸浮顆粒等對人體有害的物質。
[0003]目前，雖然秸桿利用的方法有很多，在不同地區的效果也不錯，但由于技術和成本的原因，秸桿在工業及能源領域的應用尚存在一定程度的制約；此外，由于目前收集、運輸秸桿成本高而收購價格低，農民缺少積極性，因而并未從根本上解決秸桿出路問題，農民們仍然在年復一年地就地焚燒大量秸桿。
[0004]就中國乃至全世界的秸桿利用情況來看，秸桿還田是目前適用范圍最廣，最容易推廣的利用方法。秸桿還田可以將秸桿中的C、N、K、P及微量元素釋放到大田，大量研究結果表明，秸桿還田能有效改善土壤物理性狀，增加土壤養分含量，有利于土壤中有機質的積累，長期保持秸桿還田，可以有效解決目前中國耕地生產力和肥力下降問題，同時顯著提高作物產量并減少甚至替代部分化肥的使用。然而，秸桿不經處理直接還田在自然條件下腐解速度慢，影響播種、出苗和苗期生長；而且秸桿覆蓋后會給病蟲害提供越冬場所，易使下茬作物發生各類病蟲害。
[0005]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),是一種耐熱、好氧的G+桿狀細菌,該菌能產生抗逆性強的芽孢，能顯著抑制病原菌，是一種常見的植物根圍促生細菌(PGPR)，也是目前生防細菌中研究和應用較多的一類細菌；`同時，大量的報道也證實，芽孢桿菌可以產生胞外纖維素酶、半纖維素酶等，可以有效降解木質纖維素。因此，在秸桿降解過程中，利用可產生降解木質纖維素酶類的生防枯草芽孢桿菌加速秸桿木質纖維素的降解，使養分最有效的釋放；同時，作為生防菌的芽孢桿菌對大田作物本身不僅無害，還兼具對病原微生物的拮抗作用，從而降低病害發生風險。枯草芽孢桿菌生長繁殖快、營養需求低、對人畜無害、能夠抑制多種作物病害并產生脂肽化合物，且其批量生產工藝簡單、成本較低、施用方便、儲存期長、不會讓農作物產生抗藥性，這些優點使之成為一種理想的作物秸桿降解制劑。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提出一種能夠有效降解作物秸桿、同時能拮抗作物病原菌的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)LNXM37。
[0007]為達此目的，本發明采用以下技術方案:
[0008]一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) LNXM37,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年9月9日，保藏編號為CGMCCN0.8141。
[0009]該菌為革蘭氏陽性菌，桿狀，無莢膜，好氧，周生鞭毛，能運動。菌落表面粗糙不透明，微黃色。生理生化特性:接觸酶陽性，V-P反應呈陽性，水解淀粉、酪素，不產生吲哚。以16S rDNA 測序結果與 Genbank 上(http://www.ncb1.nlm.nih gov/blast/Blast.cgi)已知序列進行比對，與Bacillus subtilis BIl相似度為100%。
[0010]包含所述枯草芽孢桿菌LNXM37和/或其代謝產物并以其為活性成分的微生物制劑也屬于本發明的保護范圍。
[0011]優選地，所述微生物制劑為液態。
[0012]本發明還提供了上述微生物制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0013](I)將所述枯草芽孢桿菌LNXM37接種于LB固體培養基，于28~37°C下培養14~24小時獲得菌體；
[0014](2)將步驟(1)獲得的菌體接入LB液體培養基中，于28~37°C下振蕩培養12~24小時制成種子液；
[0015](3)按體積百分比為5%的接種量，將步驟(2)所得種子液接種于發酵培養基中，于28~37°C下發酵培養至少36~48小時，收集發酵液即得所述微生物制劑。
[0016]上述制備方法中，優選地，所述發酵培養基包括如下重量百分比的組分:小麥秸桿粉I~3%、優選2%，磷酸氫二鉀0.1~0.5%、優選0.2%，硝酸鈉0.3~0.8%、優選0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、優選1%。
[0017]本發明還提供了所述枯草芽孢桿菌LNXM37的應用，具體應用如下:
[0018]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在作物秸桿降解中的應用；優選地，所述作物秸桿為小麥稻桿；
[0019]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治水稻紋枯病中的應用；
[0020]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治油菜菌核病中的應用；
[0021]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在促進水稻和油菜生長中的應用。
[0022]本發明提供的枯草芽孢桿菌LNXM37對小麥秸桿等作物秸桿有明顯的降解效果，并且對水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌等植物病原菌有明顯的抑制效果。本發明枯草芽孢桿菌LNXM37單獨作用于秸桿時，秸桿秸桿失重率可達35.2%，纖維素降解率達26.0%，半纖維素降解率達25.2%，木質素降解率達48.5%。
[0023]保藏信息
[0024]保藏日期:2013年9月9日；
[0025]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱:CGMCC)，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，100101 ；
[0026]保藏編號:CGMCCN0.8141。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為實施例1分離的部分菌株的BOX-PCR指紋圖譜。
[0028]圖2為基于16S rDNA序列構建的系統發育樹。
[0029]圖3為實施例2所述對31株生防芽孢桿菌的平板篩選的部分結果(A)、胞外外切纖維素酶活(B)和半纖維素酶活(C)測定結果。[0030]圖4為本發明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨降解時小麥秸桿粉的失重率曲線。
[0031]圖5為本發明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨降解時小麥秸桿粉的纖維素降解率曲線。
[0032]圖6為本發明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨降解時小麥秸桿粉的半纖維素降解率曲線。
[0033]圖7為本發明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨降解時小麥秸桿粉的木質素降解率曲線。
[0034]圖8顯示了分離的本發明枯草芽孢桿菌LNXM37的抑菌活性；從左到右依次為對水稻紋枯病菌(A)和油菜菌核病菌(B)的抑菌活性效果圖；其中，CK代表空白對照組，LNXM37代表本發明枯草芽孢桿菌LNXM37處理組。
【具體實施方式】
[0035]為更好地說明本發明，便于理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的實施例如下。
[0036]實施例1具有生防效應的芽孢桿菌的分離、篩選與鑒定
[0037]采用五點取樣法，于西藏拉薩市、林芝地區、山南地區和日喀則地區，不同環境條件下共采集35個土樣，以稀釋涂平板法對菌株進行分離純化，分離得到1388個菌株。然后，以水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)和油菜菌核病菌(Sc lerotinia sclerotiorum)為指不菌，最后得到311株抑菌效果較好的菌株(抑菌圈直徑> 5mm)。對這311個抑菌效果好的分離菌株進行基因組rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR)指紋圖譜篩選,共得到 150 個指紋圖譜不一樣菌株(指紋圖譜見圖1)。對經過指紋圖譜篩選獲得的150個菌株進行生理生化鑒定，將150個菌株分為7個類群，然后，從每個類群中選取代表性的菌株共31個株系進行脂肪酸氣相色譜(fatty acid methyl ester, FAME)和16S rDNA分子鑒定(見圖2),最后，綜合表型鑒定和一系列分子鑒定的結果，將分離的、有生防潛力的31個芽孢桿菌菌株鑒定為:短小芽孢桿菌(B.pumilus) 11株,臘樣芽孢桿菌(B.cereus) 7株,蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis) 3株,解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) 3株,萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus) 3 株，B.axarquiensis2 株，枯草芽抱桿菌(B.subtilis) I 株，地衣芽抱桿菌(B.1icheniformis) I 株。
[0038]實施例2兼具生防和秸桿降解潛力菌株的篩選
[0039]以實施例1所鑒定的31株生防芽孢桿菌為基礎，以平板透明圈法進行第一輪初篩，得到可以產生胞外木質纖維素降解酶的菌株27株，部分平板篩選結果見圖3A。緊接著以不同性質的多糖底物測定這27株芽孢桿菌胞外酶活力的大小，胞外外切纖維素酶活和半纖維素酶活測定結果分別見圖3B和圖3C。最后綜合初篩和復篩結果，得到2株兼具生防和秸桿降解潛力的菌株GBSW19和LNXM37。
[0040]實施例3菌株LNXM37對小麥秸桿粉的實際降解效果綜合測評
[0041]將實施例2所得平板上活化的LNXM37菌株挑至液體LB培養基中，于37°C、200rpm振蕩培養12小時制成種子液，再以體積百分比為2%的接菌量轉接至添加小麥秸桿粉(5目)為唯一碳源的Hutchinson培養基中振蕩培養,于不同天次收集培養液，并以差重法和改進的Van Voest法測定小麥秸桿粉的失重率、纖維素降解率、半纖維素降解率和木質素降解率，最終得到菌株LNXM37對小麥秸桿粉的實際降解效果綜合測評結果(見圖4-7)。
[0042]圖4-7結果顯示:菌株LNXM37單獨作用于秸桿時，秸桿失重率可達35.2%，纖維素降解率達26.0%，半纖維素降解率達25.2%，木質素降解率達48.5%。
[0043]實施例4本發明枯草芽孢桿菌LNXM37的抑菌活性
[0044]a.對病原細菌水稻白葉枯病菌的抑菌篩選
[0045]將指示菌病原細菌水稻白葉枯病菌按一定比例(1:30)加入冷卻到50°C左右的NA培養基中混勻，制成含菌平板，在距離中心2.5cm處十字垂直放置4個直徑為4_的濾紙片，吸取待測菌株菌液5 μ 1，接種于濾紙片上，對照不接種測試菌，用無菌水代替，每個處理重復三次。置于28°C培養箱共培養2-3天后，觀察并記錄結果。
[0046]b.對病原真菌油菜菌核病菌的拮抗篩選
[0047]在26°C培養箱中活化的油菜菌核病病菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7cm的菌碟(取指示菌邊緣生長旺盛的菌絲塊)，接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊2.5cm處，呈“十”字形分布的四個接種點，放上直徑4mm的濾紙小圓片，取待測菌液5ul點在濾紙片中央，對照不接種測試菌，用無菌水代替，每個處理重復3次，放入26°C恒溫培養箱中培養2-3天后，取出觀測并記錄抑菌結果。
[0048]c.對病原真菌水稻紋枯病菌的拮抗篩選
[0049]在28°C培養箱中活化的水稻紋枯病菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7cm的菌碟(取指示菌邊緣生長旺盛的菌絲塊)，接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊2.5cm處，呈“十”字形分布的四個接種點，放上直徑7mm的濾紙小圓片，取待測菌液5ul點在濾紙片中央，對照不接種測試菌，用無菌水代替，每個處理重復3次，放入26°C恒溫培養箱中培養3-5天后，取出觀測并記錄抑菌結果。`
[0050]本發明枯草芽孢桿菌LNXM37能夠有效抑制水稻紋枯病菌和油菜菌核病菌，其抑菌圈直徑均>5_，如圖8的A和B所示；對水稻白葉枯病菌則無明顯抑制效果。
[0051] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明，但本發明并不局限于上述，即不意味著本發明必須依賴上述才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
【權利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LNXM37,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年9月9日，保藏編號為CGMCC N0.8141。
2.一種微生物制劑，其特征在于，包含權利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37和/或其代謝產物。
3.根據權利要求2所述的微生物制劑，其特征在于，所述微生物制劑為液態。
4.如權利要求3所述微生物制劑的制備方法，包括如下步驟: (1)將所述枯草芽孢桿菌LNXM37接種于LB固體培養基，于28~37°C下培養14~24小時獲得菌體； (2)將步驟(1)獲得的菌體接入LB液體培養基中，于28~37°C下振蕩培養12~24小時制成種子液； (3)按體積百分比為5%的接種量，將步驟(2)所得種子液接種于發酵培養基中，于28~37°C下發酵培養至少36~48小時，收集發酵液即得所述微生物制劑； 優選地，所述發酵培養基包括如下重量百分比的組分:小麥秸桿粉I~3%、優選2%，磷酸氫二鉀0.1~0.5%、優選0.2%，硝酸鈉0.3~0.8%、優選0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、優選1%。
5.權利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在作物秸桿降解中的應用；優選地，所述作物稻桿為小麥稻桿。
6.權利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治水稻紋枯病中的應用。
7.權利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治油菜菌核病中的應用。
8.權利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在促進水稻和油菜生長中的應用。
【文檔編號】A01N63/00GK103589671SQ201310561031
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月12日 優先權日:2013年11月12日
【發明者】高學文, 臧昊昱, 伍輝軍, 張萬寬 申請人:無錫亞克生物科技有限公司