耐高溫植酸酶及其用途
【專利摘要】本發明涉及耐高溫植酸酶及其用途，屬于生物【技術領域】。本發明所要解決的技術問題是提供一種耐高溫植酸酶。本發明耐高溫植酸酶的氨基酸序列如seq?ID?NO1所示。本發明耐高溫植酸酶酶活力達到5062FTU/g，90℃保溫30min酶活力仍然具有4708FTU/g，酶高溫耐受性良好，同時水分含量僅為1.62%，重金屬鋁和砷分別為0.63mg/kg和0.47mg/kg，以上指標均達到或超過目前國際先進產品標準。本發明耐高溫植酸酶經養雞場試用，效果穩定，良好。本發明為飼料領域提供了一種新的有機飼料添加劑，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】耐高溫植酸酶及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及耐高溫植酸酶及其用途，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]磷是動物必需的一種常量礦物元素,磷的添加對配合飼料生產成本及產品質量有重要影響。作為豬、禽飼料主要來源的玉米、豆餅柏、谷糠、棉籽餅柏等，它們所含的磷約40-70%以植酸磷的形式存在。而豬、禽等單胃動物，由于消化道內缺乏能分解消化植酸磷的微生物，僅能利用玉米種磷的10-20%、豆餅中磷的25-35%，典型豬日糧中磷的利用率只有15%，其余85%左右的磷從糞便中排出。因此，一方面為滿足豬禽生長對磷的需要，必須在飼料中添加足夠的無機磷酸鹽，這樣就增加了飼料成本；另一方面，糞便中排出的大量的磷又造成了對土壤和水源的污染。磷存在于土壤便面，不僅能在土壤中滲透和擴散，還會與銅、鋁、鈣等元素形成不溶性復合物而保留在土壤中。如果土壤中磷大量積聚并溢出，將隨著土壤的侵蝕流動，造成自然界水體的污染。一些國家從環保的角度對集約化畜牧場已提出了限制排磷的要求。荷蘭于1998年通過了 MINAS (—種新的礦物元素結賬系統)的立法，其中嚴格限制了動物糞便中磷酸鹽的排放量。此外，植酸鹽通過螯合作用還可降低動物對鋅、錳、鐵、鈣、鉀等主要微量元素的利用率，通過與蛋白質結合成植酸復合體而降低動物對蛋白質的消化吸收率，從而使整個飼料的利用率降低。
[0003]隨著人們對綠色食品消費需求的增加和對畜牧業生產與過程中生態環境保護的重視，飼用酶制劑以其高效、安全、低成本等特點，已成為世界新型飼料添加劑研究和應用的熱點。植酸酶(Phytase)即肌醇六磷酸水解酶(Myo-1nositol hexaphosphatephosphohydrotase)，是催化植酸(即肌醇六磷酸)及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。大量研究表明，在豬、禽日糧中添加植酸酶，可使飼料中磷的利用率提高40-60%，糞便中磷的排出量減少30-50%左右。目前全世界已公認，要提高飼料中植酸磷的利用率，減少豬、禽糞便中植酸磷`對環境的污染，降低植酸磷對其它微量元素及蛋白質利用率的影響，應用植酸酶是一種有效的方法。其中來源于無花果酶(A.ficuum)的植酸酶PhyA因其具備良好特性被認為是目前最有效的飼料用植酸酶。
[0004]作為用于飼料工業的酶制劑，由于飼料制粒工藝和動物生理生化的要求，真正得到推廣利用的植酸酶必須是具有良好熱穩定性，同時又必須在動物正常體溫下具有較高的酶活性。如何解決使其耐短暫制粒高溫、又能在動物正常體溫下具有高酶活性這一對矛盾是目前包括植酸酶在內的所有飼用酶制劑均需解決的問題。此外，植酸酶催化的反應pH也必須與動物消化道相適應。不同的動物消化道的PH值不同，即使是一種動物在消化道的不同部位pH值也不同，一般的pH值胃為1.5-3.5，小腸為5-7、大腸為7左右，因此要求飼用酶對pH值有較大的適應范圍。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種耐高溫植酸酶。[0006]本發明耐高溫植酸酶的氨基酸序列如seq ID NOl所示。
[0007]其中，本發明還提供了所述的耐高溫植酸酶用作飼料添加劑的用途。
[0008]另外，本發明還提供了含有上述植酸酶的飼料。
[0009]本發明植酸酶通過下述方法制備得到:
[0010]1、采用3D構建結合軟件(Biosist和哥倫比亞大學自編的軟件結合http://www.sbR.bio, ic.ac.uk/servers/3dpssm/)預測,選擇定點突變的氨基酸。采用軟件預測技術，預測非保守區選擇氨基酸的突變造成酶本身Tm值的變化，選擇Tm值增大的氨基酸變化進行定點突變。通過對無花果曲霉(Aspergillus ficuum)植酸酶(EC3.1.3.26)非保守活性位點(1-33 ;361-441)進行系列定點突變，通過軟件重建(Biosist和哥倫比亞大學的軟件)發現27位氨基酸發生突變對Tm值影響最大，但對活性中心空間結構改變不明顯。利用軟件進行3D重建植酸酶解折疊溫度，結果表明27位氨基酸由Gln突變為Gly后，其Tm值由72.5°C增加到83.3°C，且相對酶活力基本不變。
[0011]2、設計一對含預定突變的完全互補的寡核苷酸引物，突變堿基位于引物中央，兩側為10~15個正確的堿基；引物長度25~45個堿基，GC含量大于40%，3 ^末端應為堿基G或C, Tm值不低于78°C。Stratagene公司給予上述原則開發出了在線的突變引物設計軟件，與 QuikChange?Site Directed Mutagenesis Kit 配合使用。
[0012]突變選擇正確的突變質粒，電擊轉化進行重組酵母的平板篩選。電擊培養在MD平板上的轉化子，3d后可觀察到直徑約為2mm的乳白色菌落。培養到第5d后，將所有的單菌落分別點種到MM平板和MD平板，并設陽性對照GSl15Albumin (His+Muts)和陰性對照GSl 15 β -gal (His+Mut+)，30°C培養2d或更長時間，篩選出在MD上生長正常，在MM上生長緩慢或不生長的菌落，為陽性菌落。通過平板篩選的陽性轉化子用YPD液體培養基搖瓶培養16-20h,取200 μ I細胞懸液，`收集細胞，用滅菌蒸餾水等體積洗滌2次后，重懸與200 μ I去離子水，取1μ I細胞懸液于總體積為50 μ I的PCR反應體系中，并以相應表達片段的PCR產物作對照。PCR呈陽性結果的轉化子進行表達研究。
[0013]將經平板篩選和PCR檢測后的重組酵母接種于IOml的BMGY中，36 °C培養16h (0D600=10~20)，按5%的接種量接種于200ml的BMGY中。培養20h后，室溫靜置4h，傾去培養液，加入200ml的BMMY(2%甲醇誘導)。胞內表達重組酵母30°C繼續誘導培養4d，收獲細胞。分泌表達的重組酵母30°C繼續誘導培養48h，收獲培養液上清。通過酶活測定，酶活最高為243FTU/ml，選取最高酶活的重組酵母進行培養，收集、分離，得到植酸酶粗酶。
[0014]3、植酸酶粗酶純化，純化采用濃縮、噴霧干燥，噴霧條件為:進風溫度為90°C,出風溫度為60°C，吹風壓力為0.2Mpa，收集得到植酸酶粉。
[0015]植酸酶粉測定酶活后，按照5100FTU/g的配比加入制粒保護劑，進入流化床造粒，最終得到植酸酶顆粒。
[0016]本發明耐高溫植酸酶在溫度50°C以下時，植酸酶活性比較穩定；本發明植酸酶樣品在造粒加工前后的酶活損失率< 5%。加工后的酶穩定性增加，90°C，30分鐘后，酶活回收率還可達到95%以上。加工后的酶樣在常溫下保存，其活性損失比未加工樣品低90%以上。顆粒劑保存期在室溫下可達到I年。同時該酶PH穩定性范圍變寬(1.5-7.0)。
[0017]本發明耐高溫植酸酶經四川省農科院分析測試中心檢測，酶活力達到5062FTU/g，90°C保溫30min酶活力仍然具有4708FTU/g，酶高溫耐受性良好，同時水分含量僅為1.62%，重金屬鋁和砷分別為0.63mg/kg和0.47mg/kg,以上指標均達到或超過目前國際先進產品標準。本發明耐高溫植酸酶經養雞場試用，效果穩定，良好。本發明為飼料領域提供了一種新的有機飼料添加劑，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1:純化與后加工工藝流程圖；
[0019]圖2:植酸酶SDS-PAGE電泳圖；
[0020]圖3:溫度-酶活曲線圖；
[0021]圖4:溫度-相對酶活曲線圖；
[0022]圖5:pH—酶活性曲線圖；
[0023]圖6:酸堿穩定性曲線圖；
[0024]圖7:pH值對菌體生長和酶活的影響曲線圖；
[0025]圖8:溫度對菌體生長和酶活的影響曲線圖；
[0026]圖9:通氣條件對菌體生物量和酶活的影響曲線圖；
[0027]圖10:接種量對產酶的影響曲線圖；
[0028]圖11:產酶曲線圖；
[0029]圖12:混合均勻度實驗曲線圖。
【具體實施方式】
[0030]本發明耐高溫植酸酶的氨基酸序列如seq ID NOl所示。
[0031]其中，本發明還提供了所述的耐高溫植酸酶用作飼料添加劑的用途。
[0032]另外，本發明還提供了含有上述植酸酶的飼料。
[0033]本發明植酸酶通過下述方法制備得到:
[0034]1、采用3D構建結合軟件(Biosist和哥倫比亞大學自編的軟件結合http://www.sbR.bio, ic.ac.uk/servers/3dpssm/)預測,選擇定點突變的氨基酸。采用軟件預測技術，預測非保守區選擇氨基酸的突變造成酶本身Tm值的變化，選擇Tm值增大的氨基酸變化進行定點突變。通過對無花果曲霉(Aspergillus ficuum)植酸酶(EC3.1.3.26)非保守活性位點(1-33 ;361-441)進行系列定點突變，通過軟件重建(Biosist和哥倫比亞大學的軟件)發現27位氨基酸發生突變對Tm值影響最大，但對活性中心空間結構改變不明顯。利用軟件進行3D重建植酸酶解折疊溫度，結果表明27位氨基酸由Gln突變為Gly后，其Tm值由72.5°C增加到83.3°C，且相對酶活力基本不變。
[0035]2、設計一對含預定突變的完全互補的寡核苷酸引物，突變堿基位于引物中央，兩側為10~15個正確的堿基；引物長度25~45個堿基，GC含量大于40%，3 ^末端應為堿基G或C, Tm值不低于78°C。Stratagene公司給予上述原則開發出了在線的突變引物設計軟件，與 QuikChange?Site Directed Mutagenesis Kit 配合使用。
[0036]突變選擇正確的突變質粒，電擊轉化進行重組酵母的平板篩選。電擊培養在MD平板上的轉化子，3d后可觀察到直徑約為2mm的乳白色菌落。培養到第5d后，將所有的單菌落分別點種到MM平板和MD平板，并設陽性對照GSl15Albumin (His+Muts)和陰性對照GSl 15 β -gal (His+Mut+)，30°C培養2d或更長時間，篩選出在MD上生長正常，在MM上生長緩慢或不生長的菌落，為陽性菌落。通過平板篩選的陽性轉化子用YPD液體培養基搖瓶培養16-20h,取200 μ I細胞懸液，收集細胞，用滅菌蒸餾水等體積洗滌2次后，重懸與200 μ I去離子水，取1μ I細胞懸液于總體積為50 μ I的PCR反應體系中，并以相應表達片段的PCR產物作對照。PCR呈陽性結果的轉化子進行表達研究。
[0037]將經平板篩選和PCR檢測后的重組酵母接種于IOml的BMGY中，36 °C培養16h (0D600=10~20)，按5%的接種量接種于200ml的BMGY中。培養20h后，室溫靜置4h，傾去培養液，加入200ml的BMMY(2%甲醇誘導)。胞內表達重組酵母30°C繼續誘導培養4d，收獲細胞。分泌表達的重組酵母30°C繼續誘導培養48h，收獲培養液上清。通過酶活測定，酶活最高為243FTU/ml，選取最高酶活的重組酵母進行培養，收集、分離，得到植酸酶粗酶。
[0038]3、植酸酶粗酶純化，純化采用濃縮、噴霧干燥,噴霧條件為:進風溫度為90°C,出風溫度為60°C，吹風壓力為0.2Mpa，收集得到植酸酶粉。
[0039]植酸酶粉測定酶活后，按照5100FTU/g的配比加入制粒保護劑，進入流化床造粒，最終得到植酸酶顆粒。
[0040]本發明耐高溫植酸酶在溫度50°C以下時，植酸酶活性比較穩定；本發明植酸酶樣品在造粒加工前后的酶活損失率< 5%。加工后的酶穩定性增加，90°C，30分鐘后，酶活回收率還可達到95%以上。加工后的酶樣在常溫下保存，其活性損失比未加工樣品低90%以上。顆粒劑保存期在室溫下可達到I年。同時該酶PH穩定性范圍變寬(1.5-7.0)。
[0041]下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。
[0042]實施例1
[0043]1、材料與方法
[0044]1.1所用質粒和菌株如表1所示。
[0045]表1
[0046]
【權利要求】
1.耐高溫植酸酶，其特征在于:所述耐高溫植酸酶的氨基酸序列如seqID NOl所示。
2.權利要求1所述的耐高溫植酸酶用作飼料添加劑的用途。
3.含有權利要求1所述的植酸酶的`飼料。
【文檔編號】A23K1/165GK103849607SQ201410105675
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月20日 優先權日:2013年3月21日
【發明者】彭應基, 王軍 申請人:成都國錦生物科技有限公司