本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種甜菊(SteviarebaudianaBertoni)植物花藥分離方法，可用于甜菊花藥離體培養誘導單倍體植株的研究。

背景技術：

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)作為新興的天然高甜度低熱量糖源植物，其種質資源研究和優良新品種培育對甜菊產業的發展十分重要。因為甜菊具有異花授粉和自交不親和的特性，其自交結實率極低，由于遺傳背景復雜，雜交后代群體性狀分離顯著，難以直接獲得自交系及純合體植株，在一定程度上減緩了甜菊育種進程。

通過組織培養等方法誘導植物大孢子、小孢子獲得單倍體植株再加倍是獲得純合體植株卓有成效的方法，在玉米、小麥、甘藍等許多植物中已獲得成功，然而在甜菊中鮮有研究，目前尚無成功的報道。誘導單倍體植株通常采用小孢子處于單核靠邊期的花藥進行花藥培養、游離小孢子培養，或進行未受精胚珠、未受精子房培養等。由于甜菊的花十分微小，小孢子處于單核靠邊期時對應的花蕾僅長約2毫米，使得分離花藥十分困難。而本發明首次公開一種可以簡單快速地從微小甜菊花蕾中完整分離出花藥的方法，提高了分離成功率，并有效降低了花藥培養中的污染情況。

技術實現要素：

技術問題

本發明目的是要解決從長約2毫米的甜菊微小花蕾中分離出完整花藥的技術問題，提供一種適用于甜菊花藥培養的花藥分離方法。

技術方案

本發明的技術方案如下：

一種適用于甜菊花藥離體培養的花藥分離方法，其步驟如下：

(1)花序采集：于甜菊盛花期從植株上采集花蕾1.8-2.2毫米長，苞片緊閉的頭狀花序，置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，4℃冰箱中保存備用；

(2)花序消毒：在超凈工作臺中，將頭狀花序先用75％乙醇消毒30秒后，1％升汞浸泡3-4分鐘，再用無菌水清洗3-4次，然后將花序放置于鋪有無菌濾紙的培養皿中晾干；

(3)花藥分離：用無菌小鑷子剝開苞片，從花序中拔取一個花蕾，用無菌解剖針針尖刺破花蕾的花冠頂部，再用無菌解剖針針尖段從花冠基部向頂部滾動式碾壓，將筒狀花藥從花冠頂部破口處擠出。

所述培養皿為：在干凈培養皿中鋪3-4張濾紙，用報紙包裹，高溫高壓滅菌備用。

所述花藥分離過程中：用無菌小鑷子剝開苞片，從花序中拔取一個花蕾，并將其置于75％乙醇消毒的左手食指指腹上，用右手持解剖針刺破花蕾的花冠頂部并從花冠基部向頂部滾動式碾壓。

有益效果

本專利首次針對甜菊花蕾微小，小孢子處于單核靠邊期時對應的花蕾僅長約2毫米，使得分離花藥十分困難的問題，巧妙地利用花藥合生成筒狀的特征，發明了該方法，提供了一種簡單高效的甜菊花藥分離方法，所得花藥可直接用于單倍體誘導培養。

采用本發明方法可極大地降低了剝取甜菊微小花藥的操作難度，保證了所得花藥的完整性，并有效降低了培養中的污染率，提高了工作效率。

附圖說明

圖1：甜菊花序、花蕾、花藥

①甜菊頭狀花序；②小孢子單核靠邊期對應的花序大小；③花蕾；④花藥

圖2：甜菊花蕾結構示意圖

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的闡述。

實施例1

本發明為一種適用于甜菊花藥培養的花藥分離方法，包括以下操作步驟：

(1)無菌培養皿的準備：在干凈培養皿中鋪3-4張濾紙，用報紙包裹，按常規高溫高壓滅菌方法滅菌備用。

(2)花序采集：于甜菊(品種‘中山5號’，見高苷甜菊新品種中山5號的選育-《中國糖料》2015年04期)盛花期從植株上采集苞片緊閉，花蕾長約2毫米的頭狀花序，置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，4℃冰箱中保存備用。

(3)花序消毒：在超凈工作臺中，將頭狀花序先用75％乙醇消毒30秒后，1％升汞浸泡3-4分鐘，再用無菌水清洗3-4次，然后將花序放置于鋪有無菌濾紙的培養皿中晾干。

(4)花藥分離：用無菌小鑷子剝開苞片，從花序中拔取單個花蕾，并將其置于75％乙醇消毒的左手食指指腹上，右手持解剖針用針尖刺破花蕾的花冠(圖2)頂部，再用無菌解剖針針尖段從花冠基部(即花冠與子房連接處)向花冠頂部滾動式碾壓，將筒狀花藥從花冠頂部破口處擠出。

所得花藥可作為外植體直接接種于培養基上，進行單倍體誘導培養，或進行小孢子分離，用于游離小孢子培養。

采用本發明方法可極大地降低了剝取甜菊微小花藥的操作難度，保證了所得花藥的完整性，并有效降低了培養中的污染率，提高了工作效率。