本發明涉及組織培養技術領域，更具體地，涉及一種兩面針再生苗的組培培養基和培養方法。
背景技術：
兩面針（Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.）為蕓香科花椒屬植物，具有很高的藥用價值，其干燥根入藥，為我國南方地區常見中藥，1977年開始被收入《中國藥典》。兩面針具有行氣止痛、活血化瘀、祛風通絡之功效。其中的氯化兩面針堿可以抗肝癌和乳腺癌；兩面針還是牙膏工業的原料。兩面針分布于我國南方各省，生于山野坡地灌木叢中。兩面針分布雖然廣闊，但資源并不豐富。由于兩面針用量巨大，其野生資源幾近枯竭，市場上兩面針藥材的偽品因此也較多。恢復兩面針的資源首先需要種苗。可以通過種子萌發、扦插繁殖和組織培養獲得種苗。組織培養的研究集中在兩面針的快速繁殖，即采用帶腋芽的莖段為外植體，通過叢生芽的誘導來實現增殖，但這些方法的繁殖系數較低。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種兩面針再生苗的組培培養基。
本發明的第二個目的是提供一種兩面針再生苗的組培方法。
本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：
6-糠基氨基嘌呤在兩面針組織培養中的應用，所述6-糠基氨基嘌呤在培養基中的濃度為0.2～6 mg/L。
發明人研究發現在兩面針中加入6-糠基氨基嘌呤（又名激動素，簡稱KT）可誘導出兩面針愈傷組織，利用愈傷組織進行組織培養，可提高增殖系數，實現快速繁殖。
發明人研究發現，兩面針組織培養較為復雜，外植體在誘導長成愈傷組織后，不同生長階段所需的生長物質的種類和含量顯著不同，因此本發明提供了一套從愈傷組織誘導到生根的培養基，即提供一種兩面針再生苗的組培培養基，包括愈傷組織誘導培養基、芽分化培養基、芽增殖培養基和生根培養基；所述愈傷組織誘導培養基為MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA；所述芽分化培養基分為第一次芽分化培養基和第二次芽分化培養基，所述第一次芽分化培養基為MS＋1.0～4.0 mg/L KT＋0.1～0.2 mg/L IBA，所述第二次芽分化培養基為MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA或者MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；所述芽增殖培養基為MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.8 mg/L IBA或者MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；所述生根培養基為1/2MS＋0.2～2.0 mg/L KT＋1.0 mg/L IBA。
優選地，所述愈傷組織誘導培養基為MS+4.0 mg/L KT＋2.0 mg/LNAA；所述芽分化培養基為MS+6.0 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA；所述芽增殖培養基為MS＋4.0 mg/L KT＋0.8 mg/L NAA；所述生根培養基為1/2 MS＋0.2 mg/L KT＋1.0 mg/L IBA。
本發明還提供一種兩面針組織培養的方法，包括以下步驟：
（1）以兩面針無根苗的莖段為外植體，進行愈傷組織的誘導；所述愈傷組織誘導培養基為MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA；
（2）將愈傷組織在分化培養基中分兩次進行分化培養，以得到帶芽愈傷組織；所述第一次芽分化培養基為MS＋1.0～4.0 mg/L KT＋0.1～0.2 mg/L IBA，所述第二次芽分化培養基為MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA或者MS＋2.0～6.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；
（3）將帶芽的愈傷組織在芽增殖培養基中培養，以獲得更多的再生芽，并改善芽的質量；所述芽增殖培養基為MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.8 mg/L IBA或者MS＋2.0～4.0 mg/L KT＋0.4～0.8 mg/L NAA；
（4）將所得芽從基部切下，轉接到生根培養基中誘導生根；所述生根培養基為1/2 MS＋0.2～2.0 mg/L KT＋1.0 mg/L IBA。
優選地，步驟（1）、（2）、（3）、（4）的培養條件均為：溫度23～27℃，相對濕度40%～60%，光照強度為32.5～34.5 μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
優選地，步驟（1）的兩面針無根苗的莖段的獲得方法為：取帶腋芽的兩面針的幼嫩莖段，消毒后，再接種于MS+1.0～2.0 mg/L KT＋0.2～0.4 mg/L NAA培養長成3～4cm的無根苗，再截取無根苗的莖段即可。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明以兩面針無根苗的莖段為外植體，在含有適宜激素配比的MS培養基上誘導愈傷組織形成；采用先誘導分化，再提高分化率和改善芽的質量的策略，誘導芽的分化，經生根誘導后獲得兩面針再生苗。本發明建立了經過愈傷組織階段獲得再生苗的組織培養體系，本發明采用了先提高芽分化率，再改善芽的質量的方案，從而獲得了高繁殖系數且質量好的種苗，現有通過叢生芽的誘導來實現增殖的方法的增殖系數為2.4～3.6，本發明的方法兩面針的繁殖系數達到5.0，高于快速繁殖方法的繁殖系數，如果繼代培養愈傷組織1次，則繁殖系數加倍到10.0，如果繼代培養愈傷組織2次，則繁殖系數為20.0，這是快速繁殖方法沒有的優勢，本發明所述培養基和培養方法為大量種植兩面針奠定基礎。
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
植物材料：兩面針無根苗莖段。帶腋芽的兩面針幼嫩莖段采自廣州中醫藥大學藥用植物園，用70%乙醇浸泡30秒，再用0.1%HgCl2浸泡8分鐘，用0.5%NaClO浸泡10分鐘，最后用無菌水沖洗3次，接種于MS＋2.0 mg·L-1 KT＋0.4 mg·L-1 NAA中培養，12天后開始生長，約12周后可長成3～4 cm的無根苗。
以MS培養基為基礎培養基，添加蔗糖30 g·L-1，卡拉膠8.0 g·L-1，pH5.8～6.0作為基礎培養基。植物生長物質包括α－萘乙酸（α-naphthalene acetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）、6-糠基氨基嘌呤（kinetin，KT）。
愈傷組織誘導率：分別在莖段愈傷誘導培養第10、20、30天，觀察愈傷組織生長情況，統計誘導率（誘導率=(出愈外植體數/接種外植體總數)×100%）。
愈傷組織分化率：愈傷組織分化培養4周或8周，統計愈傷組織分化率（分化率=(分化出芽的愈傷組織塊數/接種的愈傷組織總塊數)×100%）。
芽增殖系數：芽分化培養8周后，轉接至增殖培養基中培養。培養4周或8周統計芽增殖系數(芽增殖系數=全部增殖芽數/接種芽數)。
生根率：生根培養8周，統計生根率（生根率=(生根的芽數/接種的芽數)×100%）。
實施例1
一、愈傷組織的誘導
在無菌條件下將無根苗的莖切成約6 mm的小段，水平放置在愈傷組織誘導培養基的表面（愈傷組織誘導培養基的組成具體見表1）；每瓶接種3段；每種培養基各接種25瓶。培養條件：溫度（25±2）℃，相對濕度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半，一個月繼代1次。
兩面針莖段在三種不同植物生長物質組合構成的誘導培養基（A1、A2、A3培養基由基礎培養基和表1中的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同）中都能產生愈傷組織，說明適當濃度的KT和NAA能夠誘導產生愈傷組織。比較三種培養基產生愈傷組織的效果，在A3培養基中的誘導率最高，達到74.84%；其次是A1培養基，誘導率為66.84%；最差的是A2培養基，誘導率只有58.76%。產生的愈傷組織的質量也有不同，在A3和A1上產生的愈傷組織的顏色是淡黃色、顆粒狀、質地疏松而且濕潤的；而在A2上產生的愈傷組織的顏色是淡黃色、塊狀、質地干硬的；因此A3和A1培養基上產生的愈傷組織比較適宜作為愈傷組織分化的材料，由于A3培養基上的誘導率最高，所以選取A3培養基誘導的愈傷組織進行分化實驗。
二、愈傷組織的分化
將繼代1次，在A3培養基中誘導的愈傷組織塊切成5 mm×5 mm大小，接種于分化培養基中（表2，培養基B1、B2、B3由基礎培養基和表2的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同），每瓶接種4塊，每種培養基各接種50瓶。培養1個月后，將在培養基B3上產生的愈傷組織再轉移到另4種分化培養基中培養（表3），每個培養皿接種8塊，每種培養基各接種12個培養皿。培養條件：溫度（25±2）℃，相對濕度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
結果見表2。在培養基B1中沒有芽的分化。而在培養基B2和B3上可以分化出芽，但分化率低，只有4.50%和12.50%，每塊愈傷組織的芽平均數為1.00和1.30。在培養基B1上沒有分化出芽的原因可能是KT的濃度太低。從表2的結果可以看出，三種培養基中，含4 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA的B3培養基對愈傷組織分化有一定的效果，但效果還不夠理想。為了進一步提高芽的分化率，將在B3進行過分化培養的不含芽的愈傷組織，轉移到其他四種分化培養基中繼續進行芽的分化培養（表3，B3、B4、B5、B6由基礎培養基和表3的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同）。
從表3結果可以看出，四種含植物生長物質組合的培養基都可以促進芽的分化，在培養基B4中的愈傷組織的分化效果較好，芽分化率為36.46%，顯著高于在其它三個培養基中的分化率，且每塊愈傷組織的平均芽數達到3.30。在培養基B3、B5和B6的中的愈傷組織芽分化率分別為20.83%、16.67%和23.96％，它們之間沒有顯著性差異。四種培養基中，B4的KT含量最高，分化出的芽較小、顏色偏黃、葉片細小，說明芽的質量較差。因此表3的結果表明，高濃度的KT對芽的分化有利，但KT的濃度太高，會使芽的質量變差。
綜合表2和表3的結果分析，在芽分化培養中，除了KT的濃度不能過低外，生長素的濃度對芽的分化率也有影響，在KT濃度相同的處理中，生長素濃度高，則有芽分化率高的趨勢。另外，表3的B3培養基的芽分化率高于表2中的B3培養基的芽分化率，原因可能是表3的愈傷組織的培養時間較長。
三、芽的增殖
將來自分化培養基B4的帶芽愈傷組織轉接到芽增殖培養基中（表4），每個培養皿接種6塊愈傷組織，每塊愈傷組織帶1～2個芽，每種培養基各接種8個培養皿。4周后繼代1次，接種到培養瓶中，每瓶接種3塊帶1～2個芽的愈傷組織，每種培養基各接種16瓶。培養條件：溫度（25±2）℃，相對濕度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
B4培養基中芽的分化率明顯高于其它培養基，但芽的質量較差，可能的原因是B4培養基的KT濃度過高。為了獲得高的芽分化率而又得到好質量的芽，將B4培養基上的芽重新轉接到低KT濃度的B3、B5和B6培養基中進行增殖培養。結果見表4。從表4可以看出，培養4周和8周后，芽增殖效果最好的是B6培養基，其芽增殖系數分別是3.33（培養4周）和5.00（培養8周）。其次是B3培養基，培養4周和8周后，芽增殖系數分別是2.66和3.50。增殖系數較高的這兩個培養基的KT濃度都是4.0 mg·L-1，它們的芽生長速度較慢，芽稍短，但芽的顏色較綠，說明芽的質量是好的。B5培養基上的增殖效果最差，它的KT濃度為2.0 mg·L-1。所以，在增殖培養中，KT的濃度過低不利于芽的增殖。
比較B5和B6培養基中的植物生長物質組成，它們的KT與NAA的濃度比值都是5，但兩者芽的增殖效果卻不同，這說明當細胞分裂素和生長素比值相同，而它們的絕對濃度不同時，芽的分化能力也有差異，也就是說，芽的分化能力不但受細胞分裂素與生長素的比值的影響，還受兩種激素的絕對濃度影響。4.0 mg·L-1 KT和0.8 mg·L-1 NAA的生長物質的組合更有利于芽的增殖。
四、生根培養
增殖培養后，將來自培養基B6的高于2 cm的芽塊（帶少量愈傷組織）轉接到1/2 MS培養基中進行生根誘導（表5），每瓶接種4塊愈傷組織，每塊帶1～3個芽，每種培養基接種20瓶。培養條件：溫度（25±2）℃，相對濕度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
取生長在B6培養基中高于2 cm的芽進行生根培養。培養4周后發現芽下部開始分化形成根。培養8周后的生根情況見表5。三種生根誘導培養基（C1、C2、C3培養基由基礎培養基和表5的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同）中，生根效果較好的是C1和C2，它們的生根率分別是66.75%和46.85%，根多且長；而C3培養基的生根率較低，為25.30%，根也較短。表5的結果表明，隨著KT濃度的升高，生根率下降。生根誘導最好的培養基是C1。
五、煉苗與移栽
將在C1培養基中獲得的再生苗進行鍛煉。把培養瓶放置在室內靠窗處接受散射的自然光照射3天，然后打開培養瓶蓋，在相同位置又放置3天。之后取出再生苗，用清水洗凈植株基部的培養基，移栽到含1/3砂、2/3土的培養基質中。除了注意在苗期時遮蔭外，不需要特別護理。移栽后的兩面針幼苗生長良好，移栽成活率為91%。
對比例1
實驗方法同實施例1，唯一不同的是：實施例1的步驟一中愈傷組織誘導培養基中不含有KT，其誘導率為1.34%～5.31%。