本發明涉及組織培養
技術領域：
，特別涉及一種黃金甲組織培養的培養基及方法。
背景技術：
：黃金甲為衛矛科衛矛屬北海道黃楊(Euonymusjaponicuscv."CuZhi")的變異品種，其葉片兩邊金黃，中間翠綠，因此得名。黃金甲株型緊湊，色澤鮮艷，并繼承了北海道黃楊的耐寒抗性好的特點，是北方缺乏的彩色不落葉植物。黃金甲直立性強、萌蘗能力強、移栽成活率高，容易養護，可培養為綠籬、圓球、綠墻等各種造型使用，是具有很大市場潛力的園林樹種。目前，黃金甲主要靠嫁接進行繁殖，費時費力，而且繁殖系數較低，成活率較低，遠不能滿足國內對種苗的需求。組織培養技術是在無菌的條件下將活器官、組織或細胞置于培養基內，并放在適宜的環境中，進行連續培養而成的細胞、組織或個體。這種技術已廣泛應用于農業和生物、醫藥的研究。近年來，組織培養技術逐漸應用到園林樹種的繁殖方面，并開始代替傳統的葉插、分株等繁殖方法。但針對黃金甲的組織培養技術還未有報道，目前只有關于北海道黃楊的組織培養技術的報道。周鑫于2004年在《北海道黃楊組織培養育苗的研究》一文中報道了一種適合北海道黃楊的組培技術，具體為：外殖體滅菌采用0.1％升汞加吐溫-80滅菌8～10min，無菌水沖洗6～8次；促進休眠芽萌發的培養基以MS為基本培養基，細胞分裂素可以用BA或KT，濃度為1.0mg/L，生長素可以用NAA或IBA，濃度為0.1mg/L；擴大繁殖培養基以MS為基本培養基，細胞分裂素用BA或KT，濃度0.1mg/L，生物素NAA或IBA，濃度在0.5～1.0mg/L。專利號為CN102293150A的專利公開了一種金葉黃楊的組織培養方法，包括：將小芽基部切成1cm長接種于小芽誘導培養基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L上，培養1個月后切下帶芽愈傷組織放入增殖培養基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L進行培養，將叢生芽放入壯苗培養基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L上進行培養，待長至2～3cm轉接入生根培養基。但上述兩種組織培養方法并不適合黃金甲的培養，采用上述兩種方法進行黃金甲的組織培養，其繁殖系數和成活率較低。因此需要研發一種適合黃金甲的組培快繁技術。技術實現要素：有鑒于此，本發明提供了一種黃金甲組織培養的培養基及方法。采用本發明提供的培養基配方可顯著提高黃金甲的繁殖系數，縮短繁殖周期，提高成活率，為黃金甲的產業化生產提供了更加有效的途徑。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種黃金甲組織培養的培養基，包括初代培養基、第一繼代培養基、第二繼代培養基和生根培養基；初代培養基為：含有0.05～0.2mg/LKT、0.06～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、12～18mL/L大蒜汁和8～11mL/L椰汁的WPM培養基，pH值為5.9；第一繼代培養基為：含有0.5～2mg/LKT、0.01～0.1mg/LTDZ、0.02～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、50mL～150mL/L番茄汁和15mL～25mL/L香蕉汁的WPM培養基，pH值為5.9；第二繼代培養基為：含有0.1～0.7mg/LKT、0.05～0.2mg/LGA3、0.04～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂的WPM培養基，pH值為5.9；生根培養基為：含有5～7g/L瓊脂和15～25g/L蔗糖的WPM培養基，pH值為5.9。采用本發明提供的培養基配方可顯著提高黃金甲的繁殖系數，縮短繁殖周期，提高成活率，為黃金甲的產業化生產提供了更加有效的途徑。優選地，初代培養基為：含有0.1mg/LKT、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、15mL/L大蒜汁和10mL/L椰汁的WPM培養基；第一繼代培養基為：含有0.5mg/LKT、0.01mg/LTDZ、0.02mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、100mL/L番茄汁和20mL/L香蕉汁的WPM培養基；第二繼代培養基為：含有0.3mg/LKT、0.05mg/LGA3、0.04mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂的WPM培養基；生根培養基為：含有7g/L瓊脂和20g/L蔗糖的WPM培養基。本發明中采用的大蒜汁、椰汁、番茄汁和香蕉汁采用過濾除菌的方式進行除菌，既保持了天然添加物的生物活性，又能夠有效除菌。本發明還提供了一種黃金甲的組織培養方法，包括如下步驟：將黃金甲外植體接種到初代培養基進行初代培養，得到芽眼開始萌動的外植體；將芽眼開始萌動的外植體轉接到第一繼代培養基進行第一次繼代培養，得到芽眼分化完成的外植體；將芽眼分化完成的外植體轉接到第二繼代培養基進行第二次繼代培養，得到叢生芽；將叢生芽轉接到生根培養基進行生根培養，得到組培苗；初代培養基為：含有0.05～0.2mg/LKT、0.06～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、12～18mL/L大蒜汁和8～11mL/L椰汁的WPM培養基，pH值為5.9；第一繼代培養基為：含有0.5～2mg/LKT、0.01～0.1mg/LTDZ、0.02～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、50mL～150mL/L番茄汁和15mL～25mL/L香蕉汁的WPM培養基，pH值為5.9；第二繼代培養基為：含有0.1～0.7mg/LKT、0.05～0.2mg/LGA3、0.04～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂的WPM培養基，pH值為5.9；生根培養基為：含有5～7g/L瓊脂和15～25g/L蔗糖的WPM培養基，pH值為5.9。本發明解決了傳統的繁殖方法中存在的繁殖系數低、成活率低的問題，利用組培技術進行黃金甲的快繁，既保持黃金甲的優良性狀，又大大提高其繁殖系數，縮短繁殖周期，為黃金甲的產業化生產提供了更加有效的途徑。同時，本發明首次對黃金甲的取材及消毒方法進行了改進，降低了初代接種的污染率。在本發明提供的實施例中，將黃金甲外植體接種到初代培養基進行初代培養之前還包括：采取黃金甲的帶芽一年生健康枝條，去掉葉片保留葉柄，進行消毒處理，然后切成有一對芽或一個頂芽的長0.5～1.0cm小段。作為優選，黃金甲的帶芽一年生健康枝條的采取時間為每年5～6月。在本發明提供的實施例中，消毒處理具體為：將去掉葉片的黃金甲枝條用水和NaClO溶液清洗，然后用酒精和氯化汞溶液消毒，再用水清洗。作為優選，NaClO溶液的質量百分濃度0.1％；酒精的體積百分濃度為75％，酒精消毒的時間為20s；氯化汞溶液的質量百分濃度為0.1％，氯化汞溶液的消毒時間為5min。作為優選，黃金甲組織培養的光照周期為8～12h/d，光照強度為2500～3500lx，培養溫度為24～26℃，相對濕度為45％～50％。在本發明提供的實施例中，黃金甲組織培養的光照時間12h/d，光照強度3500lx，培養溫度為25℃，相對濕度48％，每3d用紫外燈滅菌30min。在本發明提供的實施例中，得到組培苗后還包括煉苗的步驟。在本發明提供的實施例中，煉苗為：將組培苗打開瓶蓋通風2d，洗掉根部附著的培養基，晾干水分后栽植至培養土中，噴施含有多菌靈和代鋅蒙森混合液，放置背光處，覆膜保濕，保持溫度在15～20℃之間；待長出新葉后將苗挪至向陽處，并逐漸去掉覆膜，30～50d后轉入正常養護。在本發明提供的實施例中，煉苗過程中培養土為泥炭、珍珠巖與蛭石的質量比為1：1：1的培養土。本發明提供了一種黃金甲組織培養的培養基及方法。該培養基包括初代培養基、第一繼代培養基、第二繼代培養基和生根培養基；初代培養基為：含有0.05～0.2mg/LKT、0.06～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、12～18mL/L大蒜汁和8～11mL/L椰汁的WPM培養基，pH值為5.9；第一繼代培養基為：含有0.5～2mg/LKT、0.01～0.1mg/LTDZ、0.02～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、50mL～150mL/L番茄汁和15mL～25mL/L香蕉汁的WPM培養基，pH值為5.9；第二繼代培養基為：含有0.1～0.7mg/LKT、0.05～0.2mg/LGA3、0.04～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂的WPM培養基，pH值為5.9；生根培養基為：含有5～7g/L瓊脂和15～25g/L蔗糖的WPM培養基，pH值為5.9。本發明至少具有如下優勢之一：采用本發明提供的培養基配方可顯著提高黃金甲的繁殖系數，縮短繁殖周期，提高成活率，為黃金甲的產業化生產提供了更加有效的途徑；本發明首次對黃金甲的取材及消毒方法進行了改進，降低了初代接種的污染率。具體實施方式本發明公開了一種黃金甲組織培養的培養基及方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的黃金甲組織培養的培養基及方法中所用培養基組分均可由市場購得。其中，大蒜汁、椰汁、番茄汁、香蕉汁均為榨汁原液。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1黃金甲的組織培養1.生長環境(1)采用固體WPM培養基，所配培養基經過高壓高溫蒸汽滅菌，126℃下5min。(2)組培室，光照時間12h/d，光照強度3500lx，培養溫度為25℃，相對濕度48％，每3d用紫外燈滅菌30min。2.外植體的處理(1)每年5～6月期間采取生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段作為外植體。(2)采集完成后，先去掉葉片保留葉柄，然后用紗布包好放自來水下流水沖洗2h。(3)用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體。(4)在超凈工作臺內依次用75％酒精消毒20s、0.1％HgCl消毒5min，注：消毒液的使用次數不超過10次，達到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存，以免失效。(5)消毒完成后用無菌水清洗6遍，每次不少于3min。(6)清洗完成后，在超凈工作臺內，用手術刀和鑷子將外植體切成有一對芽或一個頂芽的長0.5-1.0cm小段待用。3.初代培養(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內，將手術刀、鑷子、接種盤用酒精燈充分消毒。(4)將清洗好的外植體用手術刀切掉底部1-2mm，接種到分裝好的初代培養基中：WPM+0.1mg/LKT+0.1mg/LNAA+15mL/L大蒜汁+10mL/L椰汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(5)培養10d后芽眼開始萌動，成活率達到95％。4.第一次繼代培養(1)選取芽眼已萌動的外植體。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心將外植體夾出，轉接到分裝好的繼代培養基：WPM+0.5mg/LKT+0.01mg/LTDZ+0.02mg/LNAA+100mL/L番茄汁+20mL/L香蕉汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(3)30d芽眼分化完成。5.第二次繼代培養(1)選取第一次繼代培養中芽眼分化完成的外植體。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心將外植體夾出，轉接到分裝好的培養基：WPM+0.3mg/LKT+0.05mg/LGA3+0.04mg/LNAA+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(3)15d叢生芽顯著長大，節間伸長1.5～2cm，繁殖系數6.07。6.生根培養(1)選取繼代培養2中叢生芽長大至3-4cm，包含2對以上側芽的小苗。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心夾出將其放在接種盤上，用手術刀切下帶芽的莖段，接入生根培養基：WPM+7g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH5.9。(3)30d后無根枝條莖段下部長出4～7條須根。7.煉苗(1)選取生長健壯，根系發達的組培苗，先打開瓶蓋通風2d，使小苗逐漸適應外界環境。(2)小心取出，不要傷到根系，清水沖洗干凈根部附著的培養基。(3)晾干水分后，栽植至滅菌過的培養土內。培養土按泥炭：珍珠巖：蛭石＝1：1：1的比例進行配置。(4)栽植后噴施適量濃度多菌靈和代鋅蒙森混合液，放置背光處，覆膜保濕，保持溫度在15-20℃之間，約20d后，新根長出。(5)芽眼開始抽出新葉，說明煉苗已經成活，可將苗挪至向陽處，并逐漸去掉覆膜，使苗適應外界環境。(6)35d即可轉入正常養護。如果發生爛苗或者真菌蔓延，則要及時挖掉死苗及周圍土壤，然后噴施高濃度多菌靈進行防治，以免影響其它幼苗成活。實驗結果顯示：在初代培養中加入15ml的大蒜汁所接種材料的成活率達到95％，10d芽眼開始萌動，第一次繼代培養基中加入0.5mg/LKT、0.01mg/LTDZ、0.02mg/LNAA、100mL/L番茄汁、20mL/L香蕉汁，30d芽眼完成分化，第二次繼代培養基中加入0.3mg/LKT、0.05mg/LGA3、0.04mg/LNAA，15d叢生芽顯著長大，節間伸長，生根培養不添加激素只添加7g/L瓊脂、20g/L蔗糖，30d后無根枝條莖段下部長出4～7條須根。實施例2黃金甲的組織培養1.生長環境(1)采用固體WPM培養基，所配培養基經過高壓高溫蒸汽滅菌，126℃下5min。(2)組培室，光照時間12h/d，光照強度3500lx，培養溫度為25℃，相對濕度48％，每3d用紫外燈滅菌30min。2.外植體的處理(1)每年5～6月期間采取生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段作為外植體。(2)采集完成后，先去掉葉片保留葉柄，然后用紗布包好放自來水下流水沖洗2h。(3)用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體。(4)在超凈工作臺內依次用75％酒精消毒20s、0.1％HgCl消毒5min，注：消毒液的使用次數不超過10次，達到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存，以免失效。(5)消毒完成后用無菌水清洗6遍，每次不少于3min。(6)清洗完成后，在超凈工作臺內，用手術刀和鑷子將外植體切成有一對芽或一個頂芽的長0.5-1.0cm小段待用。3.初代培養(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內，將手術刀、鑷子、接種盤用酒精燈充分消毒。(4)將清洗好的外植體用手術刀切掉底部1-2mm，接種到分裝好的培養基中。初代培養基為：WPM+0.2mg/LKT+0.06mg/LNAA+12mL/L大蒜汁+8mL/L椰汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(5)培養20d后芽眼開始萌動，成活率為75.8％。4.第一次繼代培養(1)選取芽眼已萌動的外植體。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心將外植體夾出，轉接到分裝好的培養基中。第一次繼代培養的培養基為WPM+2mg/LKT+0.1mg/LTDZ+0.2mg/LNAA+15mL/L香蕉汁+50ml/L番茄汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(3)50d芽眼分化完成。5.第二次繼代培養(1)選取第一次繼代培養中芽眼分化完成的外植體。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心將外植體夾出，轉接到分裝好的培養基中。第二次繼代培養的培養基為：WPM+0.1mg/LKT+0.1mg/LGA3+0.15mg/LNAA+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(3)30d叢生芽顯著長大，節間伸長3～4cm，繁殖系數0.51。6.生根培養(1)選取繼代培養2中叢生芽長大至3-4cm，包含2對以上側芽的小苗。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心夾出將其放在接種盤上，用手術刀切下帶芽的莖段，接入生根培養基中。生根培養基為：WPM+5g/L瓊脂+15g/L蔗糖，pH5.9。(3)45d后無根枝條莖段下部長出1～2條須根。7.煉苗(1)選取生長健壯，根系發達的組培苗，先打開瓶蓋通風2d，使小苗逐漸適應外界環境。(2)小心取出，不要傷到根系，清水沖洗干凈根部附著的培養基。(3)晾干水分后，栽植至滅菌過的培養土內。培養土按泥炭：珍珠巖：蛭石＝1：1：1的比例進行配置。(4)栽植后噴施適量濃度多菌靈和代鋅蒙森混合液，放置背光處，覆膜保濕，保持溫度在15-20℃之間，約20d后，新根長出。(5)芽眼開始抽出新葉，說明煉苗已經成活，可將苗挪至向陽處，并逐漸去掉覆膜，使苗適應外界環境。(6)40d即可轉入正常養護。如果發生爛苗或者真菌蔓延，則要及時挖掉死苗及周圍土壤，然后噴施高濃度多菌靈進行防治，以免影響其它幼苗成活。實驗結果顯示：在初代培養中加入12ml的大蒜汁所接種材料的成活率是75.8％，20d芽眼開始萌動，第一次繼代培養基中加入2mg/LKT、0.1mg/LTDZ、0.2mg/LNAA、15mL/L香蕉汁、50mL/L番茄汁，50d芽眼完成分化，第二次繼代培養基中加入0.1mg/LKT、0.1mg/LGA3、0.15mg/LNAA，30d叢生芽顯著長大，節間伸長，生根培養不添加激素只添加5g/L瓊脂、15g/L蔗糖，45d后無根枝條莖段下部長出1～2條須根。實施例3黃金甲的組織培養1.生長環境(1)采用固體WPM培養基，所配培養基經過高壓高溫蒸汽滅菌，126℃下5min。(2)組培室，光照時間12h/d，光照強度3500lx，培養溫度為25℃，相對濕度48％，每3d用紫外燈滅菌30min。2.外植體的處理(1)每年5～6月期間采取生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段作為外植體。(2)采集完成后，先去掉葉片保留葉柄，然后用紗布包好放自來水下流水沖洗2h。(3)用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體。(4)在超凈工作臺內依次用75％酒精消毒20s、0.1％HgCl消毒5min，注：消毒液的使用次數不超過10次，達到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存，以免失效。(5)消毒完成后用無菌水清洗6遍，每次不少于3min。(6)清洗完成后，在超凈工作臺內，用手術刀和鑷子將外植體切成有一對芽或一個頂芽的長0.5-1.0cm小段待用。3.初代培養(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內，將手術刀、鑷子、接種盤用酒精燈充分消毒。(4)將清洗好的外植體用手術刀切掉底部1-2mm，接種到分裝好的培養基中。初代培養基為：WPM+0.05mg/LKT+0.2mg/LNAA+18mL/L大蒜汁+11mL/L椰汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(5)培養20d后芽眼開始萌動，成活率為86.2％。4.第一次繼代培養(1)選取芽眼已萌動的外植體。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心將外植體夾出，轉接到分裝好的培養基中。第一次繼代培養的培養基為WPM+1mg/LKT+0.1mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+25mL/L香蕉汁+150ml/L番茄汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(3)50d芽眼分化完成。5.第二次繼代培養(1)選取第一次繼代培養中芽眼分化完成的外植體。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心將外植體夾出，轉接到分裝好的培養基中。第二次繼代培養的培養基為：WPM+0.7mg/LKT+0.2mg/LGA3+0.2mg/LNAA+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9。(3)26d叢生芽顯著長大，節間伸長4—5cm，繁殖系數為1.18。6.生根培養(1)選取繼代培養2中叢生芽長大至3-4cm，包含2對以上側芽的小苗。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心夾出將其放在接種盤上，用手術刀切下帶芽的莖段，接入生根培養基中。生根培養基為：WPM+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH5.9。(3)30d后無根枝條莖段下部長出2～3條須根。7.煉苗(1)選取生長健壯，根系發達的組培苗，先打開瓶蓋通風2d，使小苗逐漸適應外界環境。(2)小心取出，不要傷到根系，清水沖洗干凈根部附著的培養基。(3)晾干水分后，栽植至滅菌過的培養土內。培養土按泥炭：珍珠巖：蛭石＝1∶1∶1的比例進行配置。(4)栽植后噴施適量濃度多菌靈和代鋅蒙森混合液，放置背光處，覆膜保濕，保持溫度在15-20℃之間，約20d后，新根長出。(5)芽眼開始抽出新葉，說明煉苗已經成活，可將苗挪至向陽處，并逐漸去掉覆膜，使苗適應外界環境。(6)50d即可轉入正常養護。如果發生爛苗或者真菌蔓延，則要及時挖掉死苗及周圍土壤，然后噴施高濃度多菌靈進行防治，以免影響其它幼苗成活。實驗結果顯示：在初代培養中加入18ml的大蒜汁所接種材料的成活率是86.2％，20d芽眼開始萌動，第一次繼代培養基中加入1mg/LKT、0.1mg/LTDZ、0.1mg/LNAA、25mL/L香蕉汁、150ml/L番茄汁，50d芽眼分化完成，第二次繼代培養基中加入0.7mg/LKT、0.2mg/LGA3、0.2mg/LNAA，26d叢生芽顯著長大，節間伸長，生根培養不添加激素只添加7g/L瓊脂、25g/L蔗糖，30d無根枝條莖段下部長出2～3條須根。試驗例1外植體采集時間的確認，從3月1日開始到7月31日進行連續接種試驗，以下是黃金甲接種后第10天的染菌情況：表1黃金甲接種后第10天的染菌情況時間染菌率時間染菌率時間染菌率3/1—3/1020％4/21—4/3023％6/11—6/205％3/11—3/2025％5/1—5/108％6/21—6/308％3/21—3/3120％5/11—5/206％7/1—7/1025％4/1—4/1029％5/21—5/318％7/11—7/2030％4/11—4/2021％6/1—6/109％7/21—7/3035％從表1中可以看出，在5月1日到6月30日這期間的黃金甲帶腋芽的徑段接種后，染菌率在10％以下，且通過觀察，接種后材料生長快，且后期生長良好。本發明是通過以下培養基配方篩選出最適合初代培養的激素組合，具體操作如表2：表2初代培養基篩選的處理組分CK處理1處理2處理3KT(mg/L)00.20.050.1NAA(mg/L)00.060.20.1大蒜汁(mL/L)0121815椰汁(mL/L)081110說明：其中，對照CK和3個處理的基本培養基為WPM培養基；對照CK為不添加激素KT和NAA，以及天然添加物大蒜汁和椰汁。試驗結果見表3：表3初代培養基的成活率組分CK處理1處理2處理3成活率(％)36.775.886.295可見，處理3中材料成活率達95％。處理3WPM+0.1mg/LKT+0.1mg/LNAA+15mL/L大蒜汁+10mL/L椰汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9，為黃金甲最適合的初代培養基。本發明是通過以下培養基配方篩選出最適合第一次繼代培養的激素組合，具體操作如表4：表4第一次繼代培養的培養基篩選的處理組分CK處理1處理2處理3KT(mg/L)0210.5TDZ(mg/L)00.10.10.01NAA(mg/L)00.20.10.02香蕉汁(mL/L)0152520番茄汁(mL/L)050150100說明：其中，對照CK和3個處理的基本培養基為WPM培養基；對照CK為不添加激素KT、TDZ和NAA，以及天然添加物番茄汁和香蕉汁。試驗結果見表5：表5第一次繼代培養各處理的生長情況項目CK處理1處理2處理3芽眼分化少數分化少數分化少數分化已分化葉色綠玻璃化玻璃化嫩綠可見，處理3中的材料生長最好，芽眼分化最快，處理1和處理2中的NAA容易引起材料玻璃化，死亡。通過對比處理3WPM+0.5mg/LKT+0.01mg/LTDZ+0.02mg/LNAA+100mL/L番茄汁+20mL/L香蕉汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9，為最適合培養基。本發明是通過以下培養基配方篩選出最適合第二次繼代培養的激素組合，具體操作如表6：表6第二次繼代培養的培養基篩選的處理組分CK處理1處理2處理3KT(mg/L)00.10.70.3GA3(mg/L)00.10.20.05NAA(mg/L)00.150.20.04說明：其中，對照CK和3個處理的基本培養基為WPM培養基；對照CK為不添加激素KT、GA3和NAA。試驗結果見表7：表7第二次繼代培養的生長情況可見，處理3中材料的叢生芽生長顯著，處理2中GA3導致節間過長，莖段變細。通過對比處理3WPM+0.3mg/LKT+0.05mg/LGA3+0.04mg/LNAA+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH5.9，為最適合培養基。生根培養基的3個篩選處理：WPM+5～7g/L瓊脂+15～25g/L蔗糖。表8生根培養的培養基篩選的處理組分CK處理1處理2處理3瓊脂7576蔗糖30152520說明：其中，對照CK和3個處理的基本培養基為WPM培養基。試驗結果見表9：表9生根培養的生長情況組分CK處理1處理2處理3生根情況(條)1—21—22—34—7葉片顏色泛黃泛黃綠綠可見，處理3中組培苗生根最快，最多。處理3：WPM+無激素+7g/L瓊脂+20g/L蔗糖。利用本技術既保持黃金甲的優良性狀，又大大提高其繁殖系數，縮短繁殖周期，為黃金甲的產業化生產提供了更加有效的途徑。對比例1采用專利號為CN102293150A的專利中公開的金葉黃楊的培養基對黃金甲進行組織培養，除培養基不同外其它條件相同。對照培養基包括：誘導培養基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L、增殖培養基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L、壯苗培養基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。1、初代培養試驗組：WPM+0.1mg/LKT+0.1mg/LNAA+15mL/L大蒜汁+10mL/L椰汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖。對照組：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。試驗結果顯示：表10初代培養成活率結果組別成活率％試驗組95對照組46.32、第一次繼代培養試驗組：WPM+0.5mg/LKT+0.01mg/LTDZ+0.02mg/LNAA+100mL/L番茄汁+20mL/L香蕉汁+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖。對照組：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。試驗結果顯示：表11繼代培養生長情況組別芽眼分化葉色試驗組已分化嫩綠對照組未分化無3、第二次繼代培養試驗組：WPM+0.1mg/LKT+0.1mg/LGA3+0.15mg/LNAA+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖對照組：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。試驗結果顯示：表12第二次繼代培養增殖系數結果組別增殖系數試驗組6.07對照組0.864、生根培養試驗組：WPM+7g/L瓊脂+20g/L蔗糖。對照組：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。試驗結果顯示：表13生根培養結果組別生根情況(條)試驗組4～7對照組無以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3