本發明涉及植物生物
技術領域：
，尤其涉及一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法。
背景技術：
：烏桕(SapiumsebiferumRoxb)，大戟科烏桕屬落葉喬木，是一種集觀賞、藥用和油用于一體的多功能樹種。烏桕適應性強，分布廣，種子含油率高達55％，是制造蠟燭、肥皂、金屬皂、潤滑脂、合成洗滌劑，軟化劑和制取軟脂酸、硬脂酸、玻璃鋼、高級噴漆的原料。近年來烏桕種子也成為制取生物柴油的重要原料，同時也是制備巧克力、化妝品的重要原料。此外，烏桕因其葉色多變，在秋季呈現出紅、橙、黃、綠、紫和褐等顏色，又是一種具有發展潛力的景觀植物，具有廣泛應用前景。由于烏桕為多年生木本植物，且高度雜合，通過傳統的雜交育種方式很難滿足育種需求，而單倍體育種可以大大縮短育種年限，加快育種進程，在植物遺傳育種理論和實踐研究中具有廣泛的應用前景。植物花藥培養技術是最常用的獲得單倍體植株的方法，通過花藥培養可快速有效地獲得純合雙單倍體，避免了通過傳統育種手段需要多代自交才可以獲得純合穩定的品系。此外，通過花藥培養獲得的單倍體可以直接用于遺傳圖譜的構建、培育新品種或作為優良親本用于品種改良。因此，本發明以烏桕花藥為材料，建立了一套適合烏桕的簡單、快速、穩定的花藥離體再生體系，為烏桕的單倍體育種、遺傳圖譜的構建及后期種質資源的創建等提供技術支撐；同時，對烏桕的遺傳改良和新品種的選育都具有重要意義。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種適合烏桕的簡單、快速、穩定的通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法。本發明是通過以下技術方案實現的：一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法，包括如下步驟：(1)外植體的選擇選取生長至適宜時期的烏桕花序用于后續培養；(2)外植體的低溫預處理將花序裝于自封塑料袋內置于冰箱進行低溫預處理；(3)外植體的表面消毒將經過低溫預處理后的花序經流水沖洗后置于無菌操作臺中進行表面消毒；(4)愈傷組織誘導培養濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，剝取花藥，接種于愈傷組織誘導培養基中，再經過3-4周的光照培養，獲取愈傷組織；(5)愈傷組織的增殖培養將步驟(4)中獲得的愈傷組織轉接于增殖培養基中進行增殖培養；(6)愈傷組織的分化將步驟(5)中增殖后的愈傷組織切成切塊，轉接于分化培養基中進行愈傷組織的分化培養；(7)不定芽的伸長將步驟(6)中已分化出叢生芽的愈傷組織，轉接于不定芽伸長培養基中進行不定芽的伸長培養并獲取相應烏桕幼苗；(8)不定芽的生根將步驟(7)中伸長的烏桕幼苗轉接于生根培養基中進行生根培養，最終獲得烏桕再生植株。優選地，所述步驟(1)中生長至適宜時期的烏桕花序為經顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核中期或單核靠邊期的烏桕花序。優選地，所述步驟(2)中低溫預處理的方法為：將花序置于3-5℃冰箱處理6-24h。優選地，所述步驟(3)中外植體的表面消毒的具體方法為：將花序經流水沖洗20-30min后，于無菌操作臺中用無菌水沖洗3-5遍；再采用70％-75％的乙醇消毒15-20s,無菌水沖洗3-5遍，重復1次；接著，再用添加有0.5-1.0％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒60-120s，最后用無菌水再沖洗5-8遍。優選地，所述步驟(4)中花藥的剝取于無菌操作臺中借助尖頭鑷子進行。優選地，所述步驟(4)中愈傷組織誘導培養基為添加有0.6-3.0mg/LTDZ和0.6-3.0mg/LIAA的DKW培養基。優選地，所述步驟(5)中增殖培養基為添加有0.1-0.5mg/LTDZ和1.0-2.0mg/LIAA的DKW培養基。優選地，所述步驟(6)中分化培養基為添加有0.2-0.5mg/LTDZ和0.1-0.5mg/LZT的DKW培養基。優選地，所述步驟(7)中不定芽伸長培養基為添加有0.05-0.2mg/LZT的1/2DKW培養基。優選地，所述步驟(8)中生根培養基為添加有0.1-2.0mg/L亞精胺的1/2DKW培養基。本發明的優點在于：本發明所提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法，具體涉及一種以木本能源植物烏桕的花藥為外植體，通過愈傷組織的誘導、增殖和分化，最終獲得烏桕完整植株的方法；本發明建立了一套適合烏桕的簡單、快速、穩定的花藥離體再生體系，為烏桕的單倍體育種、遺傳圖譜的構建及后期種質資源的創建等提供技術支撐，同時，對烏桕的遺傳改良和新品種的選育具有重要意義。附圖說明圖1是本發明實施例1-3提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法的流程圖；圖2是本發明實施例1提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法的小孢子處于單核靠邊期的花藥圖；圖3是本發明實施例1提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法的小孢子處于單核靠邊期的花藥所對應的花序大小圖；圖4是本發明實施例1提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法的花藥愈傷組織的誘導圖；圖5是本發明實施例1提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法的愈傷組織的增殖圖；圖6是本發明實施例1提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法的愈傷組織的分化圖；圖7是本發明實施例1提供的一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法的不定芽的生根圖。具體實施方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法，如圖1所示，包括如下步驟：(1)外植體的選擇經顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核靠邊期的烏桕花藥所對應的花序用于后續培養，其中，小孢子處于單核靠邊期的花藥及花藥所對應的花序大小圖分別如圖2、圖3所示；(2)外植體的低溫預處理將花序裝于自封塑料袋內置于3℃冰箱進行低溫預處理6h；(3)外植體的表面消毒將經過低溫預處理后的花序經流水沖洗20min后置于無菌操作臺中用無菌水沖洗3遍；再采用70％的乙醇消毒15s，無菌水沖洗3遍，重復1次；接著，再用添加有0.5％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒60s，最后用無菌水再沖洗5遍；(4)愈傷組織誘導培養濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，于無菌操作臺中借助尖頭鑷子剝取花藥，接種于愈傷組織誘導培養基中，放置于光照周期為8/16(光照/黑暗)，光照強度(2000-2500lx)，溫度為(24±1)℃的恒溫培養室，經過3周的培養，獲得如圖4所示的淡綠色的花藥愈傷組織，愈傷組織的誘導率高達100％；其中愈傷組織的誘導培養基為添加有0.6mg/LTDZ和0.6mg/LIAA的DKW培養基；(5)愈傷組織的增殖培養將步驟(4)中將誘導出的直徑為4mm的花藥愈傷組織轉接于增殖培養基中進行愈傷組織的增殖培養，培養5周后愈傷組織的增殖效率最高達6.8，其中增殖培養基為添加有0.1mg/LTDZ和1.0mg/LIAA的DKW培養基；(6)愈傷組織的分化將如圖5所示的增殖后的愈傷組織切成切塊，轉接于分化培養基上，于光照周期為16/8(光照/黑暗)，光照強度(2500-3000lx)，溫度為(26±1)℃的恒溫培養室中，進行愈傷組織的分化；經過3周的光照培養，93.2％的愈傷組織分化出如圖6所示的不定芽點，其中分化培養基為添加有0.2mg/LTDZ和0.1mg/LZT的DKW培養基；(7)不定芽的伸長待不定芽長至0.5cm后，將帶有不定芽叢的愈傷組織轉接于不定芽伸長培養基中進行不定芽的伸長培養并獲取相應烏桕幼苗，其中不定芽伸長培養基為添加有0.05mg/LZT的1/2DKW培養基；(8)不定芽的生根光照培養2周后，將伸長的烏桕不定芽轉接于生根培養基中進行生根培養，1個月后獲得如圖7所示的根系健壯的烏桕再生植株，其中生根培養基為添加有0.1mg/L亞精胺的1/2DKW培養基。實施例2一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法，如圖1所示，包括如下步驟：(1)外植體的選擇經顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核中期的烏桕花藥所對應的花序用于后續培養；(2)外植體的低溫預處理將花序裝于自封塑料袋內置于5℃冰箱進行低溫預處理24h；(3)外植體的表面消毒將經過低溫預處理后的花序經流水沖洗30min后置于無菌操作臺中用無菌水沖洗5遍；再采用75％的乙醇消毒20s，無菌水沖洗5遍，重復1次；接著，再用添加有1.0％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒120s，最后用無菌水再沖洗8遍；(4)愈傷組織誘導培養濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，于無菌操作臺中借助尖頭鑷子剝取花藥，接種于愈傷組織誘導培養基中，放置于光照周期為8/16(光照/黑暗),光照強度(2000-2500lx)，溫度為(24±1)℃的恒溫培養室，經過4周的培養，獲得淡綠色的花藥愈傷組織，愈傷組織的誘導率高達100％；其中愈傷組織的誘導培養基為添加有3.0mg/LTDZ和3.0mg/LIAA的DKW培養基；(5)愈傷組織的增殖培養將步驟(4)中將誘導出的直徑為6mm的花藥愈傷組織轉接于增殖培養基中進行愈傷組織的增殖培養，培養5周后愈傷組織的增殖效率最高達6.8，其中增殖培養基為添加有0.5mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培養基；(6)愈傷組織的分化將增殖后的愈傷組織切成切塊，轉接于分化培養基上，于光照周期為16/8(光照/黑暗)，光照強度(2500-3000lx)，溫度為(26±1)℃的恒溫培養室中，進行愈傷組織的分化；經過3周的光照培養，93.2％的愈傷組織分化出不定芽點，其中分化培養基為添加有0.5mg/LTDZ和0.5mg/LZT的DKW培養基；(7)不定芽的伸長待不定芽長至1.0cm后，將帶有不定芽叢的愈傷組織轉接于不定芽伸長培養基中進行不定芽的伸長培養并獲取相應烏桕幼苗，其中不定芽伸長培養基為添加有0.2mg/LZT的1/2DKW培養基；(8)不定芽的生根光照培養2周后，將伸長的烏桕不定芽轉接于生根培養基中進行生根培養，1個月后獲得根系健壯的烏桕再生植株，其中生根培養基為添加有2.0mg/L亞精胺的1/2DKW培養基。實施例3一種通過花藥培養獲得烏桕再生植株的方法，如圖1所示，包括如下步驟：(1)外植體的選擇經顯微鏡鏡檢，選取小孢子處于單核中期的烏桕花藥所對應的花序用于后續培養；(2)外植體的低溫預處理將花序裝于自封塑料袋內置于4℃冰箱進行低溫預處理12h；(3)外植體的表面消毒將經過低溫預處理后的花序經流水沖洗25min后置于無菌操作臺中用無菌水沖洗4遍；再采用73％的乙醇消毒18s，無菌水沖洗4遍，重復1次；接著，再用添加有0.8％(v/v)Tween的0.1％(w/v)的升汞消毒100s，最后用無菌水再沖洗6遍；(4)愈傷組織誘導培養濾紙吸干步驟(3)中消毒后花序表面的水分，于無菌操作臺中借助尖頭鑷子剝取花藥，接種于愈傷組織誘導培養基中，其中愈傷組織的誘導培養基為添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培養基；(5)愈傷組織的增殖培養將步驟(4)中將誘導出的花藥愈傷組織轉接于增殖培養基中進行愈傷組織的增殖培養，其中增殖培養基為添加有0.3mg/LTDZ和1.5mg/LIAA的DKW培養基；(6)愈傷組織的分化將增殖后的愈傷組織切成切塊，轉接于分化培養基上，其中分化培養基為添加有0.3mg/LTDZ和0.3mg/LZT的DKW培養基；(7)不定芽的伸長待不定芽長至0.7cm后，將帶有不定芽叢的愈傷組織轉接于不定芽伸長培養基中進行不定芽的伸長培養并獲取相應烏桕幼苗，其中不定芽伸長培養基為添加有0.1mg/LZT的1/2DKW培養基；(8)不定芽的生根光照培養1.5周后，將伸長的烏桕不定芽轉接于生根培養基中進行生根培養，1個月后獲得根系健壯的烏桕再生植株，其中生根培養基為添加有1.0mg/L亞精胺的1/2DKW培養基。此外，上述花藥培養過程中采用的培養基種類以及相應額外添加的植物生長調節劑的種類和濃度均經過一定的實驗研究探究，其主要研究過程及結果如下：(1)不同濃度TDZ、IAA及培養基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導和增殖的影響將經表面消毒后的外植體接種于添加有不同濃度TDZ和IAA的培養基中進行愈傷組織的誘導和增殖，培養條件為：溫度(24±1℃)，光照強度2000lx,光照時間為8h/d；培養30d后，統計愈傷組織的誘導率及愈傷組織的長勢(表1)；表1TDZ與IAA結合使用對烏桕花藥愈傷組織誘導的影響從表1可知，不同濃度TDZ和IAA組合使用對烏桕花藥愈傷組織誘導率和長勢具有顯著的影響；將花藥接種于添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的DKW培養基上，愈傷組織的誘導率高達100％，且愈傷組織為綠色，質地疏松，利于后期的增殖和分化研究；(2)不同種類基本培養基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導分化的影響在上述愈傷組織誘導的基礎上，進一步測試不同種類基本培養基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導的影響，即將上述消毒后的花藥接種于添加有1.0mg/LTDZ和2.0mg/LIAA的不同類型基本培養基(MS、WPM、DKW和B5)上進行愈傷組織的誘導；表2培養基類型對烏桕花藥愈傷組織誘導的影響研究發現(表2)，培養基類型對烏桕花藥愈傷組織的誘導分化具有顯著影響，在所測試的4種類型培養基中，DKW基本培養基最有利于烏桕花藥愈傷組織的誘導，B5最不利于愈傷組織的誘導；(3)不同濃度TDZ和IAA對愈傷組織增殖的影響在愈傷組織誘導分化的基礎上，進一步測試TDZ和IAA濃度對愈傷組織增殖的影響，研究發現(表3)，通過調整TDZ和IAA的濃度，對愈傷組織的增殖系數及長勢同樣具有明顯的影響；將誘導出愈傷組織的花藥轉接于添加有0.3mg/LTDZ和1.5mg/LIAA的培養基上進行繼代培養，愈傷組織質地疏松，顏色脆綠，利于后期的分化，且愈傷組織的增殖系數高達6.8；表3不同濃度TDZ和IAA結合使用對花藥愈傷組織增殖的影響(4)不同濃度TDZ和ZT對烏桕花藥愈傷組織分化的影響將增殖后的愈傷組織切成0.1cm2大小的切塊，接種于添加有不同濃度TDZ和ZT的培養基中進行愈傷組織的分化研究；培養條件為：溫度(26±1℃)，光照強度3000lx，光照時間為16h/d；培養30d后，統計愈傷組織的分化率(表4)；表4不同濃度TDZ和ZT對烏桕花藥愈傷組織分化的影響研究結果表明，TDZ和ZT對烏桕花藥愈傷組織的分化具有明顯的影響；低濃度的TDZ和ZT更有利于愈傷組織的分化，添加有0.3mg/LTDZ和0.3mg/LZT時，愈傷組織的分化率最高達到93.2％；(5)不同濃度ZT對烏桕花藥愈傷組織分化形成的不定芽伸長的影響將分化出不定芽點的愈傷組織轉接于添加有不同濃度ZT的培養基中進行不定芽的伸長研究；培養條件為：溫度(26±1℃)，光照強度3000lx,光照時間為16h/d。培養30d后，統計不定芽的伸長情況(表5)；表5不同濃度ZT對烏桕花藥不定芽伸長的影響ZT(mg/L)芽伸長率(％)平均芽長(cm)0.0536.81.80.191.73.30.251.10.9研究結果表明，低濃度的ZT對烏桕花藥不定芽的伸長率及平均芽長具有重要的影響，培養基中添加有0.1mg/LZT時，不定芽伸長率高達91.7％，平均芽長為3.3cm；(6)不同濃度亞精胺對烏桕花藥不定芽生根的影響光照培養2周后，將伸長的不定芽轉接于添加有不同濃度亞精胺的1/2DKW培養基中進行不定芽的生根研究；培養條件為：溫度(26±1℃)，光照強度3000lx,光照時間為16h/d。培養30d后，統計不定芽的伸長情況(表6)；表6不同濃度亞精胺對烏桕花藥不定芽生根的影響研究結果表明，培養基中添加亞精胺有利于提高烏桕花藥不定芽的生根率和縮短不定根的形成時間；當培養基中添加1.0mg/L亞精胺時，不定芽生根率高達100％，平均每個外植體產生5.9個不定根，且平均根長為2.9cm，根粗壯有利于后期的移栽。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3