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牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法與流程

文檔序號:11113242閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,以開花后50~60天的牛大力果莢中取出的幼嫩子葉為培養材料,經誘導培養和繼代培養獲得繼代愈傷組織,再經懸浮細胞培養獲得穩定的牛大力懸浮細胞培養液。

2.如權利要求1所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,培養材料的獲得方法如下:選取開花后50~60d的牛大力果莢,在超凈工作臺上用棉花蘸取體積濃度為75%乙醇擦拭果莢,對果莢進行表面滅菌,然后小心剝開果莢,用滅菌的鑷子夾取果莢里面的未成熟種子,置于無菌碟子或無菌濾紙上,再用無菌解剖刀切開種皮,用無菌鑷子夾取子葉即得培養材料。

3.如權利要求1所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,所述誘導培養的方法如下:將培養材料接種至誘導培養基上于黑暗條件、24-28℃下誘導培養20-30天得到誘導愈傷組織;

所述誘導培養基的配方為:MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/LNAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

4.如權利要求3所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,所述繼代培養的方法如下:將誘導愈傷組織轉接至增殖培養基上于黑暗條件下進行繼代培養2-4次,至獲得繼代愈傷組織,每次繼代培養的時間為7-10天,培養溫度為24-28℃;

所述增殖培養基的配方為:MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/LPVP+200mg/L蘆薈汁+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂。

5.如權利要求4所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,所述懸浮細胞培養的方法如下:將2-5g繼代愈傷組織接種至含有100-150ml液體培養基的三角瓶中,將三角瓶置于轉動頻率為90-100r/min、溫度為28℃的恒溫搖床上進行懸浮細胞培養,每10-15天轉接培養一次,轉接培養3-6次后,得到穩定的牛大力懸浮細胞培養液;

所述轉接培養即將三角瓶中的懸浮液用滅菌后的150目尼龍網過濾,將濾液轉接至含有100-150ml新的液體培養基的三角瓶中置于恒溫搖床上繼續培養;

所述液體培養基為MS培養基調整得到,其將MS培養基中的硝酸銨、硝酸鉀、無水氯化鈣、七水硫酸鎂和四水硫酸錳的含量調整為硝酸銨300~500mg/L、硝酸鉀2000~2500mg/L、無水氯化鈣50~80mg/L、七水硫酸鎂400~500mg/L、四水硫酸錳10~25mg/L,將磷酸二氫鉀更換為磷酸氫二鈉150~200mg/L,其余組分不變,然后再添加2,4-D 1~5mg/L、KT 0.5~0.75mg/L、TDZ 0.5~1mg/L、NAA0.2~0.5mg/L、PVP 200~300mg/L、葡萄糖25~30g/L、椰子汁100~150mg/L、茉莉酸甲酯10~200μmol/L,pH 5.8。

6.如權利要求5所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,將得到的穩定的牛大力懸浮細胞培養液取2ml置于100-150ml新的液體培養基中培養10-15天進行擴繁培養,獲得增殖后的懸浮細胞培養液。

7.如權利要求5所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,所述液體培養基中茉莉酸甲酯的濃度為80-100μmol/L。

8.如權利要求5所述的牛大力懸浮細胞培養的快速繁殖方法,其特征在于,培養材料經誘導培養之前,先經過如下前處理:將培養材料采用經剪裁的玉米苞葉全包覆,并用細線固定,將玉米苞葉連同培養材料一起采用滅菌過的針扎2-4個孔,再將其置入裝有前處理溶液的玻璃容器中,置于200-300高斯磁場中磁化處理2h,且在磁化處理的同時,播放輕音樂,且每播放30min之后暫停10min,播放音量控制在30-90db之間,磁化處理之后取出培養材料,用廚房紙擦干備用;

所述前處理溶液以磁化水為溶劑,配方為:0.5mg/L納米氧化鋅+0.1mg/L油菜素內酯+5g/L奶粉+1.5g/Lβ-葡聚糖+10mg/L生姜提取物。

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