技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑的油菜小孢子培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
油菜作為世界上第三大油料作物，滿足了全世界至少13%的食用油的需求。而我國的產(chǎn)量位居世界首位，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國栽培的油菜主要有白菜型油菜（Brassica rapa，n=10）、芥菜型油菜（Brassica juncea，n=18）和甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，n=19）三大類型。其中因甘藍(lán)型油菜的產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)、口感好等特性，自引入我國后被大力推廣，種植面積迅速擴(kuò)增，也是目前國內(nèi)油菜育種工作者主要的研究對象。在常規(guī)油菜品種選育過程中，要育成一個(gè)穩(wěn)定的自交系，至少需要5年。然而，通過油菜小孢子胚胎再生技術(shù)，易于進(jìn)行早期選擇，可以在較短的時(shí)間里獲得純合的育種材料，顯著縮短了育種年限。利用小孢子培養(yǎng)途徑比傳統(tǒng)選育途徑具有明顯的優(yōu)勢。通過小孢子培養(yǎng)得到的單倍體植株有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率，有利于隱性基因控制性狀的選擇；還可以快速獲得自交系的超雄株，構(gòu)建DH群體作為遺傳圖譜的構(gòu)圖群體等。因此，建立高效快速的油菜小孢子培養(yǎng)體系具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，是植物基因工程的一個(gè)新研究方向。自Licther等（1982）首次報(bào)道甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)并獲得再生植株以來，許多相關(guān)研究者對影響油菜小孢子培養(yǎng)及胚狀體再生的諸多因素進(jìn)行了研究，包括培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件、供體植株基因型及其生長條件、小孢子發(fā)育時(shí)期等。但培養(yǎng)基成分中的滲透調(diào)節(jié)劑的研究鮮有報(bào)道。因此，尋找一種更加適合的滲透調(diào)節(jié)劑對于甘藍(lán)型油菜小孢子的培養(yǎng)顯得極其重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑的油菜小孢子培養(yǎng)方法，該方法小孢子出胚率高，小孢子胚狀體植株再生率高，加倍率高，大大增加了培養(yǎng)的效率。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種利用甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑的油菜小孢子培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
（1）取甘藍(lán)型油菜作為小孢子培養(yǎng)的供體植株。
（2）從供體植株開花后的花序上取花蕾并滅菌，再將滅菌后的花蕾加入到NLN-13液體培養(yǎng)基中，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞密度調(diào)至3×105～5×105個(gè)細(xì)胞/mL，再加入30～50μL秋水仙堿溶液和50～150μL活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。
所述的NLN-13液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為： NLN液體培養(yǎng)基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2。所述的含甘露醇的NLN液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L和蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH 5.6～6.2。所述的秋水仙堿溶液的質(zhì)量百分濃度為0.3～0.8%，將秋水仙堿加到NLN-13液體培養(yǎng)基中配制得到；所述的活性炭混合液，以1L計(jì)，組成為：NLN-13液體培養(yǎng)基1L，瓊脂糖2～5g和活性炭8～15g。
（3）將小孢子混合懸浮液在黑暗條件下于30～33℃恒溫?zé)峒ぬ幚?～3天，取出在黑暗條件下于22～28℃培養(yǎng)10～15天（直至肉眼可見胚狀體時(shí)），再在黑暗條件下于22～28℃搖動(dòng)培養(yǎng)5～10天，得到子葉期胚狀體。
（4）將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天12～18小時(shí)光照、光照強(qiáng)度1000～2000lux和22～28℃條件下培養(yǎng)，形成再生芽。其中，所述再生培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：MS液體培養(yǎng)基1L，細(xì)胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，瓊脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。
（5）切取再生芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天12～18小時(shí)光照、光照強(qiáng)度2000～3000lux和22～28℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)。將根生長健壯的苗經(jīng)煉苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鑒定倍性。其中，所述生根培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：MS液體培養(yǎng)基1L，萘乙酸（NAA）0.5～1mg，蔗糖20～30g，瓊脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。
本發(fā)明中：
所述的NLN液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，維生素B1 0.5mg，維生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，葉酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，煙酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，絲氨酸100mg和余量的無菌水，pH 5.6～6.2。
所述MS液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組分為：NaH2PO4·H2O 150mg，CaCl2 113.24mg，KI 0.75mg，KNO3 2500mg，（NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 125mg，H3BO33.0mg，MnSO4·H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 2mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O0.025mg，10mg維生素B1，1mg維生素B6，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，煙酸1mg，1L無菌水；
所述的滅菌采用本領(lǐng)域常規(guī)的滅菌方法，可采用次氯酸鈉溶液通過表面消毒法將花蕾滅菌15～30分鐘，無菌水清洗3～5遍后得到滅菌后的花蕾。所述次氯酸鈉溶液，以1L計(jì)，組成為：次氯酸鈉56～100mL、無水乙醇100mm、洗潔精8～10滴和余量用無菌水補(bǔ)齊。配制的次氯酸鈉溶液的體積百分濃度為5.6～10%。
優(yōu)選的技術(shù)方案中：
步驟（2）中，所述的花蕾為長度2～4mm、花粉母細(xì)胞處于單核晚期至雙核早期，花蕾數(shù)目為80～100個(gè)。
步驟（2）中，所述的研磨、離心、棄上清及用NLN-13液體培養(yǎng)基重懸浮小孢子細(xì)胞的操作可以重復(fù)進(jìn)行1～2次，即步驟（2）的具體步驟可以如下：從供體植株上取適宜的花蕾并滅菌，再將滅菌后的花蕾加入到NLN-13液體培養(yǎng)基中研磨成懸浮液，過濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀；在沉淀中再次加入NLN-13液體培養(yǎng)基研磨成懸浮液，再次過濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液，再次得到沉淀；在沉淀中先加入10～20mL含甘露醇的NLN液體培養(yǎng)基，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，用一定量的含甘露醇的NLN液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3×105～5×105個(gè)細(xì)胞/mL，再加入秋水仙堿溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。
步驟（2）中，所述的過濾可采用44μm無菌濾網(wǎng)。
步驟（2）中，所述的離心的條件一般為：900～1200rpm離心3～5min。
步驟（3）中，所述的小孢子混合懸浮液在黑暗條件下于30～33℃恒溫?zé)峒ぬ幚恚瑹峒ず蟮男℃咦討腋∫耗軌蚋龠M(jìn)小孢子細(xì)胞的胚胎發(fā)生。
步驟（3）中，所述的子葉期胚狀體可放入3～8℃冰箱中冷藏保存，以延長胚狀體的保存期限。
步驟（3）中，在黑暗條件下的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25±2℃，即：在黑暗條件下25±2℃于培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時(shí)，再在黑暗條件下于25±2℃條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)。在黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)相對于不搖動(dòng)培養(yǎng)的小孢子吸收營養(yǎng)更充分，因此胚生長得較迅速以及較健壯。
步驟（4）中，所述的培養(yǎng)條件優(yōu)選為：每天16小時(shí)光照和25℃下培養(yǎng)。一般培養(yǎng)時(shí)間為20～30天。
步驟（4）中，所述的子葉期小孢子胚狀體接種到再生培養(yǎng)基上，只需要留下已經(jīng)直接成苗的幼芽，其他愈傷組織都不再保留，這樣既保證了苗的質(zhì)量也避免了不必要的時(shí)間浪費(fèi)。
步驟（5）中，所述的再生芽（即直接成苗的幼苗）接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：每天16小時(shí)光照和25℃下培養(yǎng)。一般培養(yǎng)時(shí)間為25～30天。
步驟（5）中，移栽時(shí)用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，剪去較長的根，以便于移栽。隨后植于裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保濕5～7天，在溫室中培養(yǎng)15～20天后移栽到大的盆缽中。
步驟（5）中，所述的鑒定采用本領(lǐng)域常用的倍性鑒定方法，如取再生植株最嫩的葉片檢測各再生植株倍性。可用美國BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析鑒定。
本發(fā)明中，采用含甘露醇的NLN液體培養(yǎng)基，以甘露醇部分代替NLN-13液體培養(yǎng)基中的蔗糖。甘露醇是一種高度溶于水的無毒中性化合物，熱水條件下溶解度更高，是一種非常常用的高滲物質(zhì)，能夠營造出有利的一個(gè)低水勢的培養(yǎng)環(huán)境。在NLN-13液體培養(yǎng)基中減少蔗糖含量，并加入一定量的甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)物，產(chǎn)生的胚胎比現(xiàn)有技術(shù)中完全用蔗糖培養(yǎng)的要大一些，再生植株的能力有所增強(qiáng)。由含甘露醇的NLN液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)的小孢子植株的加倍率高于常規(guī)方法（43～52%），而完全用蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑的NLN-13液體培養(yǎng)基中只有2～18%的植株會(huì)發(fā)生自發(fā)加倍。
可見，本發(fā)明在小孢子胚胎發(fā)生過程中采用含甘露醇的NLN液體培養(yǎng)基，以甘露醇部分代替NLN-13液體培養(yǎng)基中的蔗糖（甘露醇的質(zhì)量百分濃度從6.25%遞增到25%，相應(yīng)地，蔗糖的質(zhì)量百分濃度從6.5%遞減到0.1%），始終保持0.1%含量的蔗糖以保證碳元素的供給量，超過部分的蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑與甘露醇一起將溶液的滲透壓保持衡定，取得更好的培養(yǎng)效果。此外，在小孢子游離過程中加入秋水仙堿溶液與常規(guī)的浸泡再生植株根部的方法相比，加倍率比較高，而且用量少，污染小。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
采用易出胚的油菜品種作為供體植株，以甘露醇部分代替NLN-13液體培養(yǎng)基中蔗糖的作用，在保證碳元素供給的條件下，利用甘露醇代替或者部分代替蔗糖的滲透調(diào)節(jié)作用，提供了一種新型的油菜小孢子培養(yǎng)方法。本發(fā)明方法培養(yǎng)出的油菜出胚率最高達(dá)32個(gè)/蕾，小孢子培養(yǎng)技術(shù)的利用效率高。經(jīng)觀察記錄數(shù)據(jù)以及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，甘露醇法培養(yǎng)的小孢子胚狀體植株再生率高達(dá)94.3%，加倍率能夠達(dá)到52.4%，比常規(guī)的80%左右再生率及2～18%的加倍率要高，效果好。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1
（1）培養(yǎng)基配制
① NLN液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，維生素B1 0.5mg，維生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，葉酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，煙酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，絲氨酸100mg和余量的無菌水，過濾滅菌。
② NLN-13液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L和蔗糖130g，pH 6.0，過濾滅菌。
③含甘露醇36.5g/L的NLN液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L，甘露醇36.5g，蔗糖65g，pH6.0，過濾滅菌。
④ MS液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：NaH2PO4·H2O 150mg，CaCl2 113.24mg，KI 0.75mg，KNO3 2500mg，（NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 125mg，H3BO33.0mg，MnSO4·H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 2mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，10mg維生素B1，1mg維生素B6，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，煙酸1mg，1L無菌水。
⑤再生培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：MS液體培養(yǎng)基1L，細(xì)胞分裂素1.5mg，蔗糖25g，瓊脂粉6.5g，pH5.8，高溫高壓滅菌。
⑥生根培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：MS液體培養(yǎng)基1L，萘乙酸（NAA）1.0mg，蔗糖25g，瓊脂粉6.5g，pH5.8，高溫高壓滅菌。
（2）利用甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑的小孢子培養(yǎng)方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍(lán)型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；取花序上花瓣和花藥長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個(gè)。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精10滴+無菌水配制成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的油菜花蕾放入無菌培養(yǎng)皿中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒15分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無菌水蕩洗5次后，備用。
3）在超凈工作臺(tái)上將40個(gè)滅菌后的油菜花蕾置于無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養(yǎng)基至30mL；該懸浮液用44μm無菌濾網(wǎng)過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇36.5g/L的NLN液體培養(yǎng)基10mL，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，再用一定量的含甘露醇36.5g/L的NLN液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)細(xì)胞/mL后，加入40μL秋水仙堿溶液（質(zhì)量百分濃度為0.5%）及100μL高壓滅菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm?封口膜（美國parafilm公司）封口，后置于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理2天，然后取出置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25℃搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度1000lux、25℃條件下培養(yǎng)20～25天，直接形成再生幼芽。
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度2000lux、25℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；25～30天后將根生長健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，剪去較長的根，以便于移栽。隨后植于裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保濕5天，在溫室中培養(yǎng)15天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結(jié)果：小孢子出胚率為32個(gè)/蕾，經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，小孢子胚狀體的植株再生率為高達(dá)88.5%，加倍率達(dá)67.8%。
實(shí)施例2
（1）培養(yǎng)基配制
① NLN液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
② NLN-13液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
③含甘露醇54.8g/L的NLN液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L，54.8g甘露醇，蔗糖32.5g，pH 6.0，過濾滅菌。
④MS液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑤再生培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑥生根培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
（2）利用甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑的小孢子培養(yǎng)方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍(lán)型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；取花序上花瓣和花藥長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個(gè)。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精8滴+無菌水配制成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒15分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無菌水蕩洗5次后，備用。
3）在超凈工作臺(tái)上將40個(gè)滅菌后的油菜花蕾置于無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養(yǎng)基至30mL；該懸浮液用44μm無菌濾網(wǎng)過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇54.8g/L的NLN液體培養(yǎng)基10mL，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，再用一定量的含甘露醇54.8g/L的NLN液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)細(xì)胞/mL后，加入40μL秋水仙堿溶液（質(zhì)量百分濃度為0.5%）及100μL高壓滅菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm?封口膜（美國parafilm公司）封口，后置于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理2天；然后取出置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25℃搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度1000lux、25℃條件下培養(yǎng)20～25天，直接形成再生幼芽。
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度2000lux、25℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；25～30天后將根生長健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，剪去較長的根，以便于移栽。隨后植于裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保濕5天，在溫室中培養(yǎng)15天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結(jié)果：小孢子出胚率為30個(gè)/蕾，經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，小孢子胚狀體的植株再生率高達(dá)89.1%，加倍率達(dá)47.6%。
實(shí)施例3
（1）培養(yǎng)基配制
①NLN液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
②NLN-13液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
③含甘露醇73g/L的NLN液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L，73g甘露醇，蔗糖1g，pH6.0，過濾滅菌。
④MS液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑤再生培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑥生根培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
（2）利用甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑的小孢子培養(yǎng)方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍(lán)型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；取花序上花瓣和花藥長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個(gè)。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配制成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒15分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無菌水蕩洗5次后，備用。
3）在超凈工作臺(tái)上將40個(gè)滅菌后的油菜花蕾置于無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養(yǎng)基至30mL；該懸浮液用44μm無菌濾網(wǎng)過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇73g/L的NLN液體培養(yǎng)基10mL，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，再用一定量的含甘露醇73g/L的NLN液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)細(xì)胞/mL后，加入40μL秋水仙堿溶液（質(zhì)量百分濃度為0.8%）及100μL高壓滅菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm?封口膜（美國parafilm公司）封口，后置于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理2天；后取出置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25℃搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度1000lux、25℃條件下培養(yǎng)20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度2000lux、25℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；25～30天后將根生長健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，剪去較長的根，以便于移栽。隨后植于裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保濕5天，在溫室中培養(yǎng)15天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結(jié)果：小孢子出胚率為24個(gè)/蕾，經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，小孢子胚狀體植株再生率高達(dá)94.3%，加倍率達(dá)52.4%。
實(shí)施例4
（1）培養(yǎng)基配制
①NLN液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
②NLN-13液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
③含甘露醇73g/L的NLN液體培養(yǎng)基，以1L計(jì)，組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L，73g甘露醇，蔗糖1g，pH6.0，過濾滅菌。
④MS液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑤再生培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑥生根培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
（2）利用甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑的小孢子培養(yǎng)方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍(lán)型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；取花序上花瓣和花藥長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個(gè)。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配制成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒15分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無菌水蕩洗5次后，備用。
3）在超凈工作臺(tái)上將40個(gè)滅菌后的油菜花蕾置于無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養(yǎng)基至30mL；該懸浮液用44μm無菌濾網(wǎng)過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇73g/L的NLN液體培養(yǎng)基10mL，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，再用一定量的含甘露醇73g/L的NLN液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)細(xì)胞/mL后，加入40μL秋水仙堿溶液（質(zhì)量百分濃度為0.8%）及100μL高壓滅菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm?封口膜（美國parafilm公司）封口，不用30℃熱激處理，直接置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25℃搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度1000lux、25℃條件下培養(yǎng)20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度2000lux、25℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；25～30天后將根生長健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，剪去較長的根，以便于移栽。隨后植于裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保濕5天，在溫室中培養(yǎng)15天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結(jié)果：小孢子出胚率為22個(gè)/蕾，經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，小孢子胚狀體植株再生率高達(dá)91.6%，加倍率達(dá)50.1%。
實(shí)施例5
（1）培養(yǎng)基配制
①NLN液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
②NLN-13液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
③MS液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
④再生培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑤生根培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
（2）利用蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑的小孢子培養(yǎng)方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍(lán)型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；取花序上花瓣和花藥長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個(gè)。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配制成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒15分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無菌水蕩洗5次后，備用。
3）在超凈工作臺(tái)上將40個(gè)滅菌后的油菜花蕾置于無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養(yǎng)基至30mL；該懸浮液用44μm無菌濾網(wǎng)過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基10mL，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，再用NLN-13液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)細(xì)胞/mL后，加入40μL秋水仙堿溶液（質(zhì)量百分濃度為0.8%）及100μL高壓滅菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm?封口膜（美國parafilm公司）封口，后置于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理2天；后取出置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25℃搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度1000lux、25℃條件下培養(yǎng)20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度2000lux、25℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；25～30天后將根生長健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，剪去較長的根，以便于移栽。隨后植于裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保濕5天，在溫室中培養(yǎng)15天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結(jié)果：小孢子出胚率為48個(gè)/蕾，經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，小孢子胚狀體植株再生率達(dá)43.2%，加倍率達(dá)38.6%。
實(shí)施例6
（1）培養(yǎng)基配制
①NLN液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
②NLN-13液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
③MS液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
④再生培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
⑤生根培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。
（2）利用蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑的小孢子培養(yǎng)方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍(lán)型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體植株；取花序上花瓣和花藥長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個(gè)。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配制成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒15分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無菌水蕩洗5次后，備用。
3）在超凈工作臺(tái)上將40個(gè)滅菌后的油菜花蕾置于無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養(yǎng)基至30mL；該懸浮液用44μm無菌濾網(wǎng)過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液體培養(yǎng)基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基10mL，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，再用NLN-13液體培養(yǎng)基將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)細(xì)胞/mL后，加入40μL秋水仙堿溶液（質(zhì)量百分濃度為0.8%）及100μL高壓滅菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋后用parafilm?封口膜（美國parafilm公司）封口，不用30℃熱激處理，直接置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25℃搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度1000lux、25℃條件下培養(yǎng)20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、光照強(qiáng)度2000lux、25℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；25～30天后將根生長健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，剪去較長的根，以便于移栽。隨后植于裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保濕5天，在溫室中培養(yǎng)15天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結(jié)果：小孢子出胚率為5個(gè)/蕾，經(jīng)肉眼觀察及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，小孢子胚狀體植株再生率達(dá)38.7%，加倍率達(dá)40.6%。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。