1.一種利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)取甘藍型油菜作為小孢子培養的供體植株;
(2)從供體植株開花后的花序上取花蕾并滅菌,再將滅菌后的花蕾加入到NLN-13液體培養基中,研磨成懸浮液,過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉淀;在沉淀中加入含甘露醇的NLN液體培養基將小孢子細胞密度調至3×105~5×105個細胞/mL,再加入30~50μL秋水仙堿溶液和50~150μL活性炭混合液,得到小孢子混合懸浮液;
所述的NLN-13液體培養基,以1L計,組成為:NLN液體培養基1L,蔗糖130g,pH 5.6~6.2,過濾滅菌;
所述的含甘露醇的NLN液體培養基,以1L計,組成為:NLN液體培養基1L,蔗糖1~65g,甘露醇18.3~73g,pH 5.6~6.2;
所述的秋水仙堿溶液的質量百分濃度為0.3~0.8%;
所述的活性炭混合液,以1L計,組成為:NLN-13液體培養基1L,瓊脂糖2~5g和活性炭8~15g;
(3)將小孢子混合懸浮液在黑暗條件下于30~33℃恒溫熱激處理0~3天,取出在黑暗條件下于22~28℃培養至肉眼可見胚狀體時,再在黑暗條件下于22~28℃搖動培養5~10天,得到子葉期胚狀體;
(4)將子葉期胚狀體接種至再生培養基中,在每天12~18小時光照、光照強度1000~2000lux和22~28℃條件下培養,形成再生芽;
所述的再生培養基,以1L計,組成為:MS液體培養基1L,細胞分裂素1~1.5mg,蔗糖20~30g,瓊脂粉6.5~8.5g, pH5.6~6.0;
(5)切取再生芽接種至生根培養基上,在每天12~18小時光照、光照強度2000~3000lux和22~28℃條件下進行生根培養;
所述的生根培養基,以1L計,組成為:MS液體培養基1L,萘乙酸0.5~1mg,蔗糖20~30g,瓊脂粉6.5~8.5g,pH5.6~6.0。
2.根據權利要求1所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(2)中所述的花蕾的長度為2~4mm、花粉母細胞處于單核晚期至雙核早期,花蕾數目為80~100個。
3.根據權利要求1所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(2)為:從供體植株花序上取花蕾并滅菌,再將滅菌后的花蕾加入到NLN-13液體培養基中研磨成懸浮液,過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉淀;在沉淀中再次加入NLN-13液體培養基研磨成懸浮液,過濾所得濾液經離心、棄上清液,再次得到沉淀;在沉淀中先加入10~20mL含甘露醇的NLN液體培養基,在顯微鏡下利用血細胞計數器計算小孢子細胞濃度,用一定量的含甘露醇的NLN液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105~5×105個細胞/mL,再加入秋水仙堿溶液和活性炭混合液,得到小孢子混合懸浮液。
4.根據權利要求1或3所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(2)中所述的過濾采用44μm無菌濾網。
5.根據權利要求1或3所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(2)中所述的離心的條件為:900~1200rpm/min離心3~5min。
6.根據權利要求1所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(3)中,在黑暗條件下的培養溫度為25±2℃。
7.根據權利要求1所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(3)中所述的子葉期胚狀體轉移至再生培養基之前需在3℃~8℃中保存。
8.根據權利要求1所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(4)中所述的培養條件為每天16小時光照和25℃下培養20~30天。
9.根據權利要求1所述的利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法,其特征在于:步驟(5)中所述的培養條件為每天16小時光照和25℃下培養25~30天。