本發明屬于作物培育領域，具體涉及一種提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率方法。

背景技術：

西瓜(Citrullus lanatus)是葫蘆科重要的蔬菜作物之一，具有豐富的營養和保健功能從而深受消費者喜愛，中國作為西瓜的生產和消費大國，其產量占世界總產量的60%以上，市場前景廣闊。但是，我國西瓜育種水平相對滯后，品種類型無法完全滿足市場需求，因此提高我國西瓜育種水平、增強西瓜產業國際競爭力具有重要意義。

單倍體植株進行加倍處理后獲得雙單倍體(DH)株系對于加速育種進程、創新種質資源、遺傳圖譜構建等方面均具有重要意義。人們嘗試用多種方法獲得單倍體，通常采用的有離體雄核培養和離體雌核培養，其中以花粉或花藥為外植體的離體雄核培養研究較為深入，應用也更加普遍，特別是在十字花科和禾本科作物上。但是，在葫蘆科作物上通過離體雄核培養來誘導單倍體的形成非常困難，直至目前還沒有建立起較為成熟的誘導體系，因此研究較多的是以未授粉子房或胚珠為外植體的離體雌核培養。

離體雌核培養過程中再生植株的產生方式有兩種，一種是誘導形成愈傷組織后再分化產生芽，最后形成完整再生植株；另一種是以胚狀體發育途徑直接形成再生植株。相關研究表明，愈傷組織途徑形成的再生植株大部分起源于體細胞，而以胚狀體發育途徑產生的再生植株中單倍體植株的比例顯著高于以愈傷組織途徑形成的再生植株。這提醒我們在進行西瓜未授粉子房離體培養以創制單倍體植株的過程中，提高胚狀體的誘導率是一個需要解決的關鍵問題。

雖然現有的研究可以將秋季西瓜未授粉子房胚狀體的誘導率提高到20%左右，然而，對于春季西瓜未授粉子房胚狀體，現有技術所獲得的誘導率多在5 %以下，嚴重的限制了相關研究和產業的發展進程。

因此，以春季西瓜未授粉子房為研究對象進行探究，力爭找到提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率的方法，以期能夠加速西瓜單倍體育種進程，為我國西瓜種質資源創新、新品種選育、基因工程相關研究提供幫助，是本領域亟待解決的問題。

技術實現要素：

針對現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種提高春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率方法，該方法包括：

在接種前，進行春季西瓜未授粉子房的選樣和預處理；

所述選樣為選擇留取全部果柄的未授粉子房；

所述預處理的步驟為：

（1）將選樣所得未授粉子房置于濃度為0.02 mg/ml的TDZ中處理5-10 min；

（2）將步驟（1）所得物置于10℃下處理2 d，或置于15-20℃下處理1-2 d。

所述西瓜未授粉子房為開花前一天的西瓜未授粉子房。

優選的，所述預處理步驟（1）的處理時間為10 min。

優選的，所述預處理步驟（2）為：將步驟（1）所得物置于10℃下處理2 d，或置于15℃下處理1-2 d，或置于20℃下處理1 d。更優選的，所述預處理步驟（2）為：將步驟（1）所得物置于15℃下處理2 d。

所述方法還包括：在接種前切除經過預處理的未授粉子房的外表皮，然后進行切片，切片厚度為1 mm，再進行消毒處理。優選的，所述消毒處理為：用3%的次氯酸鈉溶液消毒2 min。

所述方法還包括進行接種和培養步驟。優選的，所述接種和培養步驟為：接種于MS+30g/L 蔗糖+7 g/L瓊脂粉+0.04mg/L TDZ的誘導胚狀體發生的培養基上，35℃黑暗條件下熱激5天后轉到組培室培養。

所述培養的時間為28天。

舉例而言，當不采用本發明預處理方法，僅進行下述處理時，秋季西瓜未授粉子房胚狀體的誘導率最高可達20.2%，但春季西瓜未授粉子房胚狀體的誘導率僅為3.5%：

取開花前一天的西瓜未授粉子房為材料，流水沖洗30min后在超凈工作臺上用75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，去除子房外表皮后橫切成1mm左右的薄片，然后在3%的次氯酸鈉溶液中消毒2min，無菌水沖洗5次后接種于MS+30g/L 蔗糖+7 g/L的瓊脂粉+0.04mg/L TDZ的誘導胚狀體發生的培養基上，35℃黑暗條件下熱激5天后轉到組培室培養，28天。

本發明的有益效果：

本發明可以大幅度的提高春季西瓜未授粉子房胚狀體的誘導率，最高可達15.9 %，同時，所得胚狀體的生長狀況良好。

附圖說明

圖1為不同果柄長度對胚狀體誘導率的影響結果圖；

圖2為未經預處理春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導情況結果圖；

圖3為經本發明預處理春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導情況結果圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述發明內容所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。

實施例1

1. 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜品種為早佳8424，由湖南省西瓜甜瓜研究所提供。試驗材料于2016年4月10日定植在湖南省西瓜甜瓜研究所科研基地的塑料大棚中，5月20日第二雌花出現時開始取樣接種。

1.2 試驗方法

1.2.1 果柄長短對胚狀體誘導率的影響

取樣時，分別摘取留取全部果柄、留取1/2果柄、去除果柄三種類型的西瓜未授粉子房為材料，用0.02%的TDZ溶液浸泡10 min后置于15℃恒溫條件下2天，然后按照已建立的技術體系進行接種，28天后分別統計西瓜未授粉子房胚狀體誘導率以探究不同果柄長度對春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率的影響。

1.2.2激素預處理方式對胚狀體誘導率的影響

以留取全部果柄的西瓜未授粉子房為材料，分別用0.00%、0.01%、0.02%、0.03%的TDZ溶液浸泡5、10、15 min后置于15℃恒溫條件下2天，以不進行激素預處理的材料為對照，然后按照已建立的技術體系進行接種，28天后分別統計西瓜未授粉子房胚狀體誘導率以探究激素預處理方式對春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率的影響。

1.2.3 溫度預處理方式對胚狀體誘導率的影響

以留取全部果柄的西瓜未授粉子房為材料，用0.02%的TDZ溶液浸泡10 min后分別置于10、15、20℃的恒溫條件下處理不同時間（1、2、3天），以置于室內變溫條件下的材料為對照，然后按照已建立的技術體系進行接種，28天后分別統計西瓜未授粉子房胚狀體誘導率以探究不同溫度預處理對春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率的影響。

上述已建立的技術體系為：

取開花前一天的西瓜未授粉子房為材料，流水沖洗30min后在超凈工作臺上用75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，去除子房外表皮后橫切成1mm左右的薄片，然后在3%的次氯酸鈉溶液中消毒2min，無菌水沖洗5次后接種于MS+30g/L 蔗糖+7 g/L的瓊脂粉+0.04mg/L TDZ的誘導胚狀體發生的培養基上，35℃黑暗條件下熱激5天后轉到組培室培養，28天后統計胚狀體誘導率。

1.3數據分析

分別統計不同處理條件下春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導率，采用SPSS軟件對以上各數據進行方差分析和Duncan，s多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同果柄長度對胚狀體誘導率的影響

西瓜未授粉子房取下后有一個預處理的過程，不會立刻接種。作者以不同果柄長度的未授粉子房為試驗材料，進行果柄長度對胚狀體誘導率影響的研究，結果如圖1 所示。

由圖1可以看出，果柄長度不同胚狀體誘導率存在顯著差異，留取全部果柄時其胚狀體誘導率最高達13.8%，而去除果柄子房的胚狀體誘導率僅為2.6%，留取1/2果柄子房的誘導率為4.4%，由此說明果柄長度能夠對春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導率產生影響，果柄長度越長預處理后其胚狀體誘導率越高。

2.2 激素預處理方式對胚狀體誘導率的影響

激素預處理方式不同，胚狀體誘導率之間存在顯著差異，結果如表1所示。由表1可知，當TDZ濃度為0時，不同預處理時間之間差異不顯著且均處于較低水平，胚狀體生長狀況一般，總體不利于再生植株的獲得。TDZ濃度為0.01 mg/ml時，相較于不用激素處理，其胚狀體誘導率顯著提高，當預處理時間達到15min時，誘導率最高可達6.0%，但隨著TDZ濃度的進一步提高，胚狀體誘導率仍有上升的空間。在TDZ濃度為0.02或0.03 mg/ml條件下，預處理時間為10或15min時，各處理之間胚狀體誘導率差異不顯著且均處于較高水平，最高可達16.7%，與未使用激素預處理的相比較顯著提高了胚狀體誘導率，由此說明激素預處理能夠顯著提高胚狀體誘導率；但試驗過程中發現，TDZ濃度達0.03 mg/ml或激素預處理時間大于15min時，雖然胚狀體誘導率較高但再生的胚狀體存在嚴重的畸形，無法形成正常再生植株，不利于單倍體植株的獲得。綜上所述認為，0.02 mg/ml的TDZ溶液預處理10min能夠顯著提高春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導率，是最佳的激素預處理方式。

表1 不同激素預處理方式對胚狀體誘導率的影響

注：不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著；一般指胚狀體特征不明顯、生長緩慢；良好指胚狀體特征明顯、生長迅速

2.3溫度預處理方式對胚狀體誘導率的影響

溫度預處理方式不同，春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率之間存在顯著差異，結果如表2所示。由表2可知，在相同預處理溫度下，不同預處理時間之間胚狀體誘導率差異顯著并呈現出一定的趨勢，預處理時間為2天時胚狀體誘導率均最高，可達15.9%，預處理時間達3天時誘導率均急劇下降，這可能是由于預處理時間過長時子房生理狀態明顯下降造成的。相同預處理時間時，隨著預處理溫度的上升，胚狀體誘導率呈現出先上升后下降的趨勢，在15℃條件下達到峰值，誘導率最高可達15.9%，由此說明15℃是較適宜于春季西瓜未授粉子房預處理的溫度。試驗過程中還發現，如果西瓜子房置于室內變溫條件下放置一段時間，其胚狀體誘導率顯著下降，放置時間達到3天時其誘導率僅為2.8%，并且胚狀體存在嚴重的畸形現象，由此說明西瓜未授粉子房的生理狀態對胚狀體的誘導率存在顯著影響。綜上認為，在15℃條件下預處理2天，能夠顯著提高春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導率，有利于再生植株的獲得。

表2 不同溫度預處理方式對胚狀體誘導率的影響

注：不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著；一般指胚狀體特征不明顯、生長緩慢；良好指胚狀體特征明顯、生長迅速

一般而言，小孢子培養過程中一般使用4℃進行預處理，能夠取得較好的效果。大孢子培養時一般使用35℃進行預處理，但預處理效果有不同報導。

本試驗采用的預處理方式，取得了較好的效果，這可能是春季西瓜未授粉子房發育時所處環境溫度變化較大，最低氣溫低從而影響其生理狀態，本發明的預處理方式顯著提高了春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導率。

預處理完成后用已建立的誘導體系進行接種培養，能夠顯著改善春季西瓜未授粉子房胚狀體誘導率低的問題。通過上述預處理手段，能夠將春季西瓜未授粉子房的胚狀體誘導率從3.5%（圖2）最高提高到15.9%(圖3)。