本發明涉及無性繁殖領域，具體為一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備。

背景技術：

蘆葦是廣泛分布于世界各地、形態上高度分化的草甸與濕地植被建群種，具有重要的生態學和經濟學價值。蘆葦在自然環境中以根狀莖繁殖為主，難以進行種子繁殖。長期大量的分株繁殖常常會導致種性的退化，從而影響植物的生活力。同時由于人類活動對生態環境的嚴重干擾，部分濕地重金屬污染程度不容樂觀。長期處于重金屬污染環境中，植物的根莖存活和繁殖往往受到抑制，而導致種群衰退。所以，避免從蘆葦原生地采取蘆葦而保護原生地生態環境的同時，又如何輕便、快速培育具有重金屬耐受性的幼苗，成為恢復蘆葦種群研究的瓶頸。

植物可通過有性的和無性的兩個生命發育周期來繁殖，對于很難以種子進行有性繁殖的植物種，由微膠囊包埋植物繁殖體制備而成的人工種子，可替代天然種子進行無性繁殖。常規的人工種子研制一直都是建立在植物單獨存在的理念之上，即通過離體組織培養產生體細胞胚或不定芽等作為包埋繁殖體，而以植物和微生物共生體為培育材料的研究很少。植物離體組織培養一般建立和維持在無菌條件下，以降低微生物污染物對體外培養的植物材料做有害競爭。而有著生態獨特性的植物內生細菌，不僅能和宿主植物協同進化，并能產生具有生物活性的代謝產物而提高植物對生物脅迫或非生物脅迫的抵抗能力。因而引入特定功能的內生細菌來增強人工種子活力和品質，將具有改良植物表型的潛力；因此本發明在離體培養條件下，制備一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種耐鎘蘆葦幼苗的人工種子的制備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：步驟如下：

步驟一：采集成熟蘆葦小穗，去內外稃，以表面無損的蘆葦種子為外植體；

步驟二：將步驟一中所述的外植體消毒后，置于誘導培養基上誘導出粘性愈傷組織；

步驟三：剝取步驟二中所述的粘性愈傷組織，將所述粘性愈傷組織轉置于新鮮的誘導培養基上，進一步誘導出胚性愈傷組織；

步驟四：將步驟三所述的胚性愈傷組織通過增殖培養，獲取胚性培養物；

步驟五：將步驟四所述的胚性培養物轉至無植物生長調節劑的再生培養基上生成完整植株；

步驟六：將步驟五中生成的完整植株進行培養，得到蘆葦再生苗；

步驟七：將步驟六所述的蘆葦再生苗轉至無菌組培瓶中進行培養，向所述無菌組培瓶中加入無菌OECD模擬廢水；采集活性污泥，將所述活性污泥離心、清洗后加入所述組培瓶中，用組培膜覆蓋瓶口，將所述組培瓶于人工氣候箱中孵育；

步驟八：取經步驟七處理的蘆葦再生苗的根組織，將所述根組織的表面進行消毒后研磨成漿，再將所述根組織的漿標準稀釋涂布于MS平板上，將所述MS平板放置在恒溫培養箱中培養，待菌落長出；

步驟九：從步驟八所述的MS平板上挑選草螺菌單菌落，接種至NB液體培養基中培養；然后離心處理所述NB液體培養基以收集菌體，清洗收集的所述菌體，使用MS液體培養基重新懸浮所述菌體制成細菌重懸液，調節所述細菌重懸液中草螺菌的OD_600nm值為0.01-1；取至少一個蘆葦胚性培養物浸入所述細菌重懸液中孵育，將所述蘆葦胚性培養物轉至無菌濾紙上除去表面菌體后，再將所述蘆葦胚性培養物置于MS平板上進行培養；

步驟十：配制人工胚乳；向所述人工胚乳溶液中加入海藻酸鈉，配制成溶膠懸液作為種皮基質，同時使用去離子水配制CaCl₂溶液作為絡合劑，將所述溶膠懸液和CaCl₂溶液分別調節pH值后滅菌處理；

步驟十一：將步驟九所述的蘆葦胚性培養物加入步驟十所述的種皮基質中，均勻混合后，再用無菌巴氏吸管每次吸入一個所述蘆葦胚性培養物，滴入步驟十所述的CaCl₂溶液中，取出后將所述蘆葦胚性培養物清洗晾干，即形成人工種子；

步驟十二：將步驟十一所述的人工種子放在MS培養基上進行萌發培養。

優選的，所述誘導培養基的制備方法為：向每升MS液體培養基中加入1mg的二氯苯氧乙酸、1mg的萘乙酸、0.5mg的6-芐基腺嘌呤、30g的蔗糖以及0.5mgL-谷氨酰胺；所述增殖培養基的配制方法為向每升MS液體培養基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的瓊脂；所述再生培養基的配置方法為：向每升MS液體培養基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的瓊脂。

優選的，步驟二所述的消毒為用質量濃度為5％的次氯酸鈉進行表面消毒，步驟二所述的粘性愈傷組織為在胚芽鞘末端的白色、半透明、有光澤組織；步驟三所述的胚性愈傷組織為表面具有細小瘤狀物和綠點的組織；步驟四所述的胚性愈傷組織通過質量濃度為2.5mgL^-1的2,4-D進行增殖培養。

優選的，步驟六所述的完整植株的高度為5cm～10cm，培養方式為轉至1/2MS液體培養基中進行水培，或以蛭石為栽培基質進行。

優選的，步驟七所述的無菌組培瓶的高為20cm、直徑為5cm，所述OECD模擬廢水的配方為向0.5L去離子水中加入160mg的蛋白胨、110mg的肉膏、30mg的尿素、28mg的K₂HPO₄、7mg的NaCl、4mg的CaCl₂·2H₂O和2mg的MgSO₄·7H₂O，配制成混合液，再用去離子水將所述混合液定容至1L，再用規格為0.22μm的濾膜過濾滅菌，即制成OECD模擬廢水；所述加入無菌組培瓶中的OECD模擬廢水的體積為150ml；所述活性污泥從污水處理廠采集，所述離心條件為于12000rpm下離心5min，所述清洗為用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3次，所述組培瓶中溶液的終濃度為2.5g VSS L^-1，所述組培膜的大小為16cm×16cm，所述人工氣候箱中的條件為溫度24℃，光照時間16h d^-1，光照強度60μmol.m^-2.s^-1，所述孵育時間為14d。

優選的，步驟八所取的根組織的重量為1g，所述研磨在無菌研缽中進行，所述恒溫培養箱中的溫度為30℃，培養時間為2d～3d。

優選的，步驟九所述的培養條件為30℃下150rpm振蕩培養24h；離心條件為12000rpm下離心5min；所述清洗為用磷酸緩沖液清洗3次，調節所述細菌重懸液中草螺菌的OD_600nm值為0.01；所述蘆葦胚性培養物數目為10個，所述細菌重懸液的體積為20mL，所述孵育的時間為30min。

優選的，步驟十所述人工胚乳以MS培養基為基本培養基，所述基本培養基中含有質量濃度為3％的蔗糖作為碳源；所述海藻酸鈉的質量濃度為3％，所述CaCl₂溶液的濃度為100mM，所述溶膠懸液和CaCl₂溶液調節后的pH值均為5.8，所述滅菌為121℃下高溫高壓滅菌20min。

優選的，步驟十一中所述的蘆葦胚性培養物表面有綠點，所述巴氏吸管的直徑為7mm，滴入所述的CaCl₂溶液中的時間為30min，用無菌水將所述蘆葦胚性培養物清洗5遍后在無菌濾紙上晾干。

優選的，步驟十二所述的每個MS培養基內放置20粒人工種子，培養條件為24℃，光照時間為16hd^-1，光照強度60μmol.m^-2.s^-1，重復培養3次。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明在離體培養條件下，調節蘆葦胚性培養物對內生草螺菌的親和能力，再以胚性培養物與草螺菌共生體為繁殖材料，經水凝膠包埋制備成蘆葦人工種子，進而通過人工種子垂直傳遞草螺菌而誘導產生耐鎘的蘆葦幼苗，適合大規模推廣。

附圖說明

圖1為本發明蘆葦愈傷組織誘導與蘆葦幼苗再生；

圖2為本發明內生細菌根定殖；

圖3為草螺菌功能鑒定；

圖4為草螺菌與蘆葦胚性培養物共培養；

圖5為蘆葦種子胚軸腐爛圖；

圖6為蘆葦人工種子耐鎘性能檢測對比圖。

其中，圖1中A為蘆葦小穗；B為蘆葦種子；C為粘性愈傷組織；D、E為胚性愈傷組織；F、G、H為蘆葦苗再生；I為水培法培育的蘆葦再生幼苗；

圖2中A為無活性污泥孵育的蘆葦再生苗；B為活性污泥孵育的蘆葦再生苗；C為活性污泥誘導再生苗側根生成；D為活性污泥孵育的蘆葦再生苗與正常蘆葦再生幼苗的對比；E為蘆葦再生苗的根組織內生細菌變性梯度凝膠電泳指紋圖譜；

圖3中A為草螺菌產吲哚乙酸功能鑒定，B為草螺菌產鐵載體功能鑒定；

圖4中A為草螺菌草OD_600nm值為0.01的孵育液孵育的蘆葦胚性培養物與正常蘆葦胚性培養物對比圖；B為經草螺菌草OD_600nm值為0.01的孵育液孵育的蘆葦再生幼苗。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

參見圖1-6，本發明提供一種技術方案步驟如下：

步驟一：采集成熟蘆葦小穗，去內外稃，以表面無損的蘆葦種子為外植體；

步驟二：將步驟一中的外植體用質量濃度為5％的次氯酸鈉進行表面消毒后，將外植體置于誘導培養基上，在外植體胚芽鞘末端誘導出白色、半透明、有光澤的粘性愈傷組織，誘導培養基的制備方法為：向每升MS液體培養基中加入濃度為1mg的二氯苯氧乙酸、1mg的萘乙酸、0.5mg的6-芐基腺嘌呤、30g的蔗糖以及0.5mg L-谷氨酰胺；

步驟三：剝取步驟二中所述的粘性愈傷組織，將所述粘性愈傷組織轉置于新鮮的誘導培養基上，進一步誘導出表面具有細小瘤狀物和綠點的胚性愈傷組織；

步驟四：將步驟三所述的胚性愈傷組織通過質量濃度為2.5mgL^-1的2,4-D進行增殖培養，獲取胚性培養物，增殖培養基的配制方法為向每升MS液體培養基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的瓊脂；

步驟五：將步驟四所述的胚性培養物轉至無植物生長調節劑的再生培養基上生成完整植株，再生培養基的配置方法為：向每升MS液體培養基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的瓊脂；

步驟六：將步驟五中生成的高度為7cm的完整植株轉至1/2MS液體培養基中進行水培，得到蘆葦再生苗，蘆葦再生苗存活率達到95％；

步驟七：將步驟六的蘆葦再生苗轉至高為20cm、直徑為5cm的無菌組培瓶中進行培養，向無菌組培瓶中加入150ml的無菌OECD模擬廢水，OECD模擬廢水的配方為向0.5L去離子水中加入160mg的蛋白胨、110mg的肉膏、30mg的尿素、28mg的K₂HPO₄、7mg的NaCl、4mg的CaCl₂·2H₂O和2mg的MgSO₄·7H₂O，配制成混合液，再用去離子水將所述混合液定容至1L，再用規格為0.22μm的濾膜過濾滅菌，即制成OECD模擬廢水；從合肥市望塘污水處理廠采集活性污泥，鑒于活性污泥法實質上是天然水體自凈化作用的強化，本發明利用活性污泥孵育蘆葦再生苗的手段定殖內生細菌，以從蘆葦根組織發掘有效內生菌資源，將活性污泥于12000rpm下離心5min、用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液清洗活性污泥3次，將活性污泥加入組培瓶中至組培瓶中溶液的終濃度為2.5g VSS L^-1，用大小為16cm×16cm組培膜覆蓋瓶口，將組培瓶于人工氣候箱中孵育14d，與同等培養條件下的無活性污泥孵育的再生苗對比，活性污泥孵育的再生苗能正常生長，且活性污泥可誘導再生苗側根生成，其根生長速度明顯快于無活性污泥孵育的再生苗；

步驟八：取1g經步驟七處理的蘆葦再生苗的根組織，將根組織的表面進行消毒后在無菌研缽中研磨成漿，再將所述根組織的漿標準稀釋涂布于MS平板上，將所述MS平板放置在30℃恒溫培養箱中培養2d～3d，待菌落長出，；對剛從合肥市望塘污水處理廠采集的原始活性污泥和孵育過蘆葦再生苗的共生活性污泥采用總DNA提取試劑盒提取總DNA，對根組織內生細菌采用CTAB法提取總DNA；通過引物341F-GC-clamp(5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')擴增微生物16S rRNA基因的V3高變區；使用DCode^TM通用突變檢測系統，經電壓80V、電泳時間14h、溫度60℃、電泳緩沖液1×TAE、上樣量10μL進行變性梯度凝膠電泳，再用銀染法染色；對變性梯度凝膠電泳圖譜上的60個優勢條帶進行切膠重擴增，克隆測序；在基因庫中選取相關的特征序列，與測序結果一起用Clustal W軟件，按照最大同源性的原則進行多重序列比對，檢測的結果表明再生苗根組織中有著豐富的內生菌資源；使用細菌DNA試劑盒提取菌落中細菌的基因組DNA，擴增細菌16S rRNA基因全長序列，引物采用27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，將純化的擴增產物連接于pEASY-T3克隆載體上，送至上海生工生物工程股份有限公司測序，在基因庫中選取相關的特征序列，與測序結果一起用Clustal W軟件，按照最大同源性的原則進行多重序列比對，通過MEGA 5.0軟件包，以鄰位連接法進行系統進化樹的估算，經引導程序檢驗生成系統發育樹，且經基因庫服務器進行同源性比較，該菌落與草螺菌GSF30同源性達99.33％，因而鑒定該菌株為草螺菌，其基因庫序列登錄號為KP713806；根據格里克曼與德紹方法(Glickmann,E.,Dessaux,Y.A.，植物病原細菌產生的吲哚化合物的索爾科斯基試劑檢討，應用與環境微生物學,1995,61:793-796.)定量檢測草螺菌的吲哚乙酸產量為60.93±1μg mL^-1，根據亞歷山大與朱伯爾方法(Alexander,D.B.,Zuberer,D.A.用鉻天青S試劑對根際細菌產鐵載體的評價，土壤生物學與肥力,1991,12:39-45.)定性檢測其產鐵載體功能，耐鎘試驗檢測其最小抑菌濃度為400μM；

步驟九：從步驟八所述的MS平板上挑選草螺菌單菌落，接種至NB液體培養基中培養；然后將NB液體培養基在12000rpm條件下離心5min以收集菌體，用磷酸緩沖液清洗3次所收集的菌體，使用MS液體培養基重新懸浮菌體制成細菌重懸液，調節草螺菌的OD_600nm值為0.01；取10個蘆葦胚性培養物浸入20mL細菌重懸液中孵育30min，將蘆葦胚性培養物轉至于無菌濾紙上，除去表面菌體，再將蘆葦胚性培養物置于MS平板上進行培養，經草螺菌OD_600nm值為0.01菌液孵育過的胚性培養物，60％能進一步分化而形成完整幼苗，且掃描電子顯微鏡可觀察到草螺菌存活于胚性培養物內，表明草螺菌成功定殖于再生苗根組織，計數為每克根組織中含4.0×10⁵CFU的草螺菌；

步驟十：以MS培養基為基本培養基，基本培養基中含有質量濃度為3％的蔗糖作為碳源，配制人工胚乳，由于蘆葦胚性培養物可在無植物生長調節劑的培養基上再生出植株，因而人工胚乳中無需加入任何植物生長調節劑；向所述胚乳溶液中加入質量濃度為3％的海藻酸鈉，配制成溶膠懸液作為種皮基質，同時使用去離子水配制100mM CaCl₂溶液作為絡合劑，將溶膠懸液和CaCl₂溶液分別調節pH值為5.8后，在121℃下高溫高壓滅菌20min；

步驟十一：將步驟九中的表面有綠點蘆葦胚性培養物加入步驟十中的種皮基質中，均勻混合；再用直徑為7mm無菌巴氏吸管每次吸入一個所述蘆葦胚性培養物，滴入步驟十中的CaCl₂溶液中30min，取出后將蘆葦胚性培養物5遍后在無菌濾紙上晾干，即形成人工種子；

步驟十二：將步驟十一所述的人工種子放在MS培養基上進行萌發培養，每個MS培養基內放置20粒人工種子，培養條件為24℃，光照時間為16hd^-1，光照強度60μmol.m^-2.s^-1，重復培養3次，統計種子萌發率為90％。4℃下存儲3個月，萌發率不變。且草螺菌根定殖仍為每克根組織4.0×10⁵CFU，這表明種皮基質與絡合劑對共培養物不產生影響。

對高于300μM的鎘濃度，蘆葦種子會出現明顯的胚軸腐爛現象。以此為基礎，將正常蘆葦種子(RZS)、水凝膠包埋的包埋蘆葦種子(RZSM)、蘆葦人工種子(SS)，以及經草螺菌孵育過的蘆葦種子(ZSH)、包埋蘆葦種子(ZSMH)、人工種子(SSH)6類種子，置于含300μM的1/2MS平板中進行耐鎘性能檢測。每板5粒種子，重復10次。50天后觀察發現：正常蘆葦種子(RZS)不能正常萌發；水凝膠包埋的蘆葦種子(RZSM)、蘆葦人工種子(SS))都能萌發，但根伸長受到抑制；經草螺菌孵育過的蘆葦種子(ZSH)、包埋種子(ZSMH)、人工種子(SSH)的萌發不受影響，且根都能正常伸長。其中人工種子(SSH)具有最發達的根系統，并能繁殖成大量幼苗。這些結果表明，人工種皮雖然可以起到阻擋金屬吸收而保護種胚的功效，但這種強化作用對蘆葦幼苗生長很有限。草螺菌的引入，明顯緩解了鎘脅迫對蘆葦幼苗生長的影響，且能誘導出大量耐鎘幼苗。在不影響蘆葦遺傳潛力的情況下，以含有草螺菌的人工種子為繁殖手段，可提高種子活力和幼苗品質，而為人工濕地建設提供優質種苗，適合大規模推廣。

盡管已經示出和描述了本發明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。