本發明涉及組織培養
技術領域：
，尤其涉及一種銀邊扶芳藤組織培養的培養基及方法。
背景技術：
：銀邊扶芳藤(Euonymusfortunei'EmeraldGaiety')為衛矛科衛矛屬常綠藤本灌木，別名爬山火兒、爬藤、爬藤衛矛、爬衛矛、爬行衛矛、滂藤、鋪地楓、千層樓、青藤。小枝方梭不明顯。生長旺盛，是庭院中常見地面覆蓋植物，點綴墻角、山石、老樹等，都極為出色。銀邊扶芳藤從扶芳藤(Euonymusfortunei)中選育出來，其葉片兩邊為銀白色，中間為綠色，葉片冬季銀邊變為紅色，且溫度越低顏色越紅。此新品種色澤鮮艷，并繼承了扶芳藤耐寒抗逆性好的特點，容易養護，是北方缺乏的彩色不落葉植物，具有很大市場潛力的園林樹種。為了提高繁殖的效率，并維持母本的優良性狀，目前，該新品種主要靠扦插進行繁殖，但扦插繁殖成苗率低，且根系弱、淺，繁殖系數不高。為了在保持母本的優良性狀的基礎上，達到快速繁殖的目的，應利用組培技術來實現對該扶芳藤新品種的快速繁殖。但是目前并沒有適用于該品種的組織培養的培養基。因此，研發一種可提高扶芳藤新品種外植體增殖系數、叢生芽個數及生根率的組織培養的培養基具有重要的現實意義。技術實現要素：有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種扶芳藤組織培養的培養基及方法，該培養基可提高扶芳藤新品種外植體的增殖系數、叢生芽個數及生根率。本發明提供了一種扶芳藤的組培的初代培養基，其為含有0.06mg/L～0.15mg/LKT、0.06mg/L～0.1mg/LNAA、0.0.3mg/L～0.1mg/LTDZ、0.1mg/L維生素C、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的1/4MS培養基。本發明還提供了一種扶芳藤的組培的繼代培養基，其為含有0.3mg/L～1mg/LKT、0.07mg/L～0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。本發明還提供了一種扶芳藤的組培的生根培養基，其為含有0.01mg/L～0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。1/4MS培養基是將MS培養基中大量元素、微量元素、有機物質、鐵鹽減半而蔗糖、瓊脂量不變的培養基，其配方為：NH4NO30.4125g/L、KNO30.475g/L、CaCl2·2H2O0.11g/L、MgSO4·7H2O0.0925g/L、KH2PO40.0425g/L、KI0.2075mg/L、H3BO31.55mg/L、MnSO4·4H2O5.575mg/L、ZnSO4·7H2O2.15mg/L、Na2MoO4·2H2O0.0625mg/L、CuSO4·5H2O0.00625mg/L、CoCl2·6H2O0.00625mg/L、FeSO4·7H2O6.95mg/L、Na2-EDTA·2H2O9.325mg/L、肌醇25mg/L、煙酸0.125mg/L、鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.125mg/L、鹽酸硫胺素(維生素B1)0.025mg/L、甘氨酸0.5mg/L，pH值為5.80。WPM培養基是適用于木本植物的培養基，其配方為K2SO40.99g/L、MgSO4·7H2O0.37g/L、KH2PO40.17g/L、NH4NO30.4g/L、MnSO4·4H2O22.5mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O0.25mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、Ca(NO3)2·4H2O0.556g/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2-EDTA37.3mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、維生素B60.5mg/L、維生素B10.1mg/L、維生素B50.5mg/L，pH值為5.80。激動素(Kinetin，KT)是一種非天然的細胞分裂素，化學名稱為6-糖基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，除具有促進細胞分裂的作用外，還具有延緩離體葉片和切花衰老，誘導芽分化和發育及增加氣孔開度的作用。萘乙酸(1-Naphthylaceticacid，NAA)，是廣譜型植物生長調節劑，能促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根增加座果，防止落果，改變雌、雄花比率等。可經葉片、樹枝的嫩表皮，種子進入到植株內，隨營養流輸導到全株。塞苯隆(thidiazuron，TDZ)，是一種新型高效的細胞分裂素用于組培能更好的促進植物的芽分化。維生素C存在植物生長過程中，起保護和屏蔽有害物質與細菌侵害的作用，在植物組織培養基中添加適量維生素C能夠起到防止褐變的作用。本發明將上述4種物質以特定比例添加到基礎培養基中，制得誘導扶芳藤的培養基、誘導扶芳藤叢生芽生根的培養基和扶芳藤組培苗煉苗的培養基，對扶芳藤外植體進行組織培養時，可顯著提高扶芳藤的增殖系數、叢生芽發生率及生根率，效果好于現有報道的培養基種類。一些實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的初代培養基，其為含有0.1～0.15mg/LKT、0.08～0.1mg/LNAA、0.05～0.1mg/LTDZ、0.5～1mg/L維生素C、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的1/2MS培養基，pH值為5.8。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的初代培養基，其為含有0.1mg/LKT、0.1mg/LNAA、0.05mg/LTDZ、0.5mg/L維生素C、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的1/2MS培養基，pH值為5.8。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的初代培養基，其為含有0.15mg/LKT、0.08mg/LNAA、0.1mg/LTDZ、1mg/L維生素C、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的1/2MS培養基，pH值為5.8。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的初代培養基，其為含有0.06mg/LKT、0.06mg/LNAA、0.03mg/LTDZ、0.1mg/L維生素C、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的1/2MS培養基，pH值為5.8。一些實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的繼代培養基，其為含有0.3～0.5mg/LKT、0.07～0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的繼代培養基，其為含有0.3mg/LKT、0.07mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的繼代培養基，其為含有0.5mg/LKT、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的繼代培養基，其為含有1mg/LKT、0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。一些實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的生根培養基，其為含有0.01～0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的生根培養基，其為含有0.01mg/LNAA、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的生根培養基，其為含有0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。一些具體實施例中，本發明提供的扶芳藤的組培的生根培養基，其為含有0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養基。本發明提供的扶芳藤組培的初代培養基、繼代培養基、生根培養基所適用的扶芳藤的品種為銀邊扶芳藤。本發明還提供了一種扶芳藤的組織培養方法，包括如下步驟：步驟1：將扶芳藤外植體接種到所述初代培養基，培養至芽眼萌動；步驟2：芽眼萌動的外植體接種至所述繼代培養基，培養至分化出叢生苗；步驟3：所述叢生苗轉接到所述生根培養基，培養后，經室外煉苗，得到扶芳藤幼苗；所述扶芳藤的品種為銀邊扶芳藤。本發明中，外植體為扶芳藤的莖段，經消毒后切成0.5～1cm的帶腋芽的莖段。本發明中，外植體獲取的時間為每年4月中旬。選取幼嫩無病蟲害的枝條，采回后摘去葉片，作為外植體。本發明中，消毒處理具體為：將扶芳藤的枝條用水沖洗后，以NaClO溶液清洗，然后經酒精浸泡、HgCl溶液浸泡，再用水浸泡。本發明中，所述用水沖洗的時間為2h；所述NaClO溶液中NaClO的質量分數為0.1％；所述酒精中乙醇的體積分數為75％，酒精浸泡的時間為20s；所述HgCl溶液中HgCl的質量分數為0.1％，HgCl溶液浸泡的時間為5min；所述用水浸泡的次數為5～6次，每次不短于3min。用水沖洗時需用雙層紗布包住外植體，在流水下沖洗2h。用水浸泡采用的水為無菌水。外植體接種至初代培養基，該操作在無菌工作臺(紫外燈殺菌15min后，接種前再以75％的乙醇溶液噴灑消毒)進行，器具(鑷子、手術刀、接種盤)用體積分數為75％的酒精噴灑消毒，接種前，內資、手術刀在酒精燈上反復燒1min。外植體接種的容器為PP塑料組培瓶(500mL)，每瓶3個外植體。本發明中，步驟1、步驟2、步驟3中所述培養的光照周期為12h/d，光照強度為3000lx，培養溫度為25℃，相對濕度為60％，每3天用紫外燈滅菌30min。外植體接入初代培養基，15～20d芽眼萌動。芽眼萌動后，繼代培養基中培養30～40d，芽眼分化完成，葉片展開，產生大量叢生苗。叢生苗在生根培養基上培養25d～35天，長出3～5條根系。本發明中，步驟3中所述煉苗于室外進行。本發明中，步驟3中所述室外煉苗為：取出組培苗，洗掉根部附著的培養基，晾干水分后栽植至培養土中，噴施含有多菌靈和代鋅蒙森混合液，放置背光處，覆膜保濕，保持溫度在15～20℃之間；待長出新葉后將苗挪至向陽處，并逐漸去掉覆膜，30d后轉入正常養護。本發明提供了適用于扶芳藤新品種銀邊扶芳藤的組織培養培養基，以1/4MS培養基為基礎，添加KT、NAA、TDZ和維生素C進行初代培養，以WPM培養基為基礎，添加KT和NAA進行幾代培養，以WPM培養基添加NAA作為生根培養基。在本發明提供培養基的誘導下，經誘導可使增殖系數提高至5.68，幼苗成活率可達93.6％。具體實施方式本發明提供了一種扶芳藤組織培養的培養基及方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明采用的試材皆為普通市售品，皆可于市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例11、生長環境(1)采用固體MS培養基，其中瓊脂質量濃度7g/L，蔗糖質量濃度30g/L，pH值為5.8，所配培養基經過高壓高溫蒸汽滅菌，126℃下5min。(2)組培室，光照時間12h/d，光照強度3000lx，培養溫度為25℃，相對濕度60％，每3d用紫外燈滅菌30min。2.外植體的處理(1)每年4月期間采取生長健康無病蟲害幼嫩帶芽的莖段作為外植體。(2)采集完成后，先去掉葉片只留腋芽，然后用紗布包好放自來水下流水沖洗2h。(3)用軟毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植體。注：在清洗時刷子要順著腋芽刷，避免將腋芽刷掉。(4)在超凈工作臺內依次用75％酒精消毒20s、0.1％HgCl消毒5min，注：消毒液的使用次數不超過10次，達到后倒掉重新配置。HgCl要求避光保存，以免失效。(5)消毒完成后用無菌水清洗5-6遍，每次不少于3min。(6)清洗完成后，在超凈工作臺內，用手術刀和鑷子將外植體切成有一對芽或一個頂芽的長0.5-1.0cm小段待用。3、初代培養(1)打開超凈工作臺紫外燈殺菌15min。(2)接種前用75％的酒精噴灑消毒。(3)在超凈工作臺內，將手術刀、鑷子、接種盤用75％酒精充分消毒。(4)接種前將手術刀、鑷子在酒精燈上反復燒1min。(5)將清洗好的外植體用手術刀切掉底部1-2mm，接種到分裝好的培養基中。初代培養基為：組1：1/4MS+0.1mg/LKT+0.1mg/LNAA+0.05mg/LTDZ+0.5mg/LVC+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。組2：1/4MS+0.15mg/LKT+0.08mg/LNAA+0.1mg/LTDZ+1mg/LVC+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。組3：1/4MS+0.06mg/LKT+0.06mg/LNAA+0.03mg/LTDZ+0.1mg/LVC+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。對照：1/4MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。各組外植體接種后進行觀察，記錄芽分化狀況。統計外植體的芽眼萌動天數、葉色、褐化百分率如下表：表1叢生芽增值情況表觀察內容芽眼萌動天數(d)葉色褐化百分率(％)組110嫩綠3組220嫩綠5.6組3未萌動無83.1對照未萌動無59.6結果表明：組1中10d后芽眼萌動，子葉展開，葉色嫩綠；組2中20d后少數材料芽眼萌動，子葉展開，沒有發生褐化情況；組3和對照中芽眼未萌動，并且部分材料發生褐化。實施例2(1)選取實施例1組1中芽眼已萌動的外植體。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心將外植體夾出轉接到分裝好的培養基中。繼代培養基為：組A：WPM+0.3mg/LKT+0.07mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。組B：WPM+0.5mg/LKT+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。組C：WPM+1mg/LKT+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。對照：WPM+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。繼代培養后，記錄芽分化狀況。統計外植體的增殖系數、叢生芽產生時間、叢生芽個數如下表：表2叢生芽增值情況表觀察內容接種外植體數(個)增殖系數叢生芽產生時間(d)叢生芽個數(個)組A1005.68305組B1003.47402組C1000.28500.18對照1000.15無無結果表明：組A中材料產生大量叢生芽，生長健康，并且繁殖系數為5.68。組B中部分材料產生叢生芽，繁殖系數為3.47。組C和對照材料不產生叢生芽或僅產生極少的叢生芽。實施例3(1)選取實施例2組1中經繼代培養中葉片已經展開，包含2對以上腋芽的小苗。(2)在超凈工作臺內，用鑷子小心夾出轉接到生根培養基：組a：WPM+0.01mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。組b：WPM+0.05mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。組c：WPM+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。對照：WPM+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。生根培養后，統計外植體生根時間，生根數。結果如下表：表3叢生芽生根情況表觀察內容接種外植體數(個)生根時間(d)生根情況(條)生根平均數(個)組a100253～53.8組b100352～32.3組c1003510對照1004000結果表明：組a～b中材料生根狀況良好，煉苗后成活率分別為93.6％、87.2％。組c和對照中材料生根情況不佳，煉苗后成活率分別為11.3％、5.4％。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3