本發明涉及一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法。

背景技術：

篩選具有較強抗旱能力的苜蓿品種對進一步挖掘和利用優異抗旱苜蓿種質資源具有重要意義。以往常用的抗旱苜蓿品種篩選方法多是通過測定田間指標或者結合若干生理指標，并采用一些公認的評定方法如直接比較法、總抗旱性評價法、隸屬函數法、層次分析法(AHP)、主成分分析法和灰色關聯度模型等對苜蓿品種進行不同抗旱級別的劃分，從中篩選出一些抗旱的苜蓿品種。目前，對苜?？购敌缘脑u價方法眾多、不統一，而這種不統一的評價方法導致了“一種苜蓿多重身份”的現象，這對進一步篩選較強抗旱能力苜蓿品種及深入挖掘其優良抗旱基因的研究很不利。因此，有必要進一步開發更加準確簡單的篩選較強抗旱苜蓿品種的方法，以挖掘和利用抗旱品種自身優良的抗逆基因。

PEG模擬干旱脅迫結合測定若干生理指標的方法能夠有效地篩選出大量的抗旱苜蓿品種。李崇巍等（2002）在室內采用PEG模擬干旱脅迫研究了21個苜蓿品種的抗旱性，結果表明隨水分脅迫加重，苜蓿葉片的膜透性增加，活性氧的氧化傷害加劇，根系活力下降，在-0.8 MPa的PEG脅迫下，苜蓿的細胞膜即受到明顯傷害，且品種間差異顯著。吳曉麗等（2008）運用灰色關聯分析法，對5項抗旱指標與5個紫花苜蓿品種抗旱性的相關性進行了分析，結果表明各指標對苜蓿抗旱性的影響，以游離脯氨酸含量最大，其次為 SOD 及 POD，再次相對含水量，而葉片水勢的影響最小。穆懷彬等（2011）用5種不同水勢（0、-0.3、-0.6、-0.9和-1.2 MPa）的PEG-6000溶液對10個苜蓿品種幼苗進行模擬干旱脅迫，比較其幼苗期的抗旱性。測定細胞膜透性，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）和類胡蘿卜素（Car）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理指標，結果表明，細胞膜透性及丙二醛含量在-0.3 MPa水勢時與對照相比變化不大，而脯氨酸含量與SOD活性均在-0.3 MPa水勢時下降。結果表明苜蓿幼苗在-0.3 MPa水勢下幾乎沒有受到干旱脅迫的傷害，而在-0.9 MPa水勢時，各測試指標的變化趨勢均出現了明顯的轉折點，說明-0.9 MPa是苜蓿幼苗耐旱的關鍵水勢點，同時苜蓿幼苗耐旱的極限在一個適當的閾值內。

以上技術雖通過PEG模擬干旱脅迫結合測定某些生理指標的方法篩選了抗旱苜蓿品種，同時確定了苜蓿幼苗抗旱的關鍵水勢點及與苜?？购敌韵嚓P的生理指標，但以上篩選方法未考慮不同PEG濃度脅迫下不同抗旱能力苜蓿品種敏感性生理指標體系不同，也缺乏極端干旱脅迫條件下，不同抗旱級別能力苜蓿品種間耐受能力的比較，以及反映苜蓿品種強抗旱性的敏感性生理指標篩選，故難以準確篩選出耐旱性較強的苜蓿品種。

技術實現要素：

本發明提供了一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法。能夠準確篩選出耐旱性較強的苜蓿品種。

本發明提供一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法，包括以下步驟：

（1）苜蓿幼苗培養；

（2）用含0.38 g/mL和0.43g/mL PEG-6000溶液的Hoagland營養液模擬干旱脅迫，對生長40-45d的苜蓿幼苗根際脅迫處理7d；

（3）分別測定2個PEG-6000濃度脅迫下苜蓿的下列生理指標：

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，測定羥自由基濃度和過氧化氫酶活性；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時，測定可溶性糖含量、葉綠素含量、POD活性、葉片相對含水量、還原性抗壞血酸含量、丙二醛和超氧陰離子自由基；

（4）根據不同濃度的PEG-6000溶液脅迫下各生理指標的敏感閾值，篩選抗旱苜蓿品種：

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，若苜蓿體內羥自由基濃度低于4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性高于251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時，若苜蓿體內的可溶性糖含量高于20.94 mg·g^-1、Chl b高于1.51 mg·g^-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g^-1、POD活性高于584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對含水量高于29.45%、還原性抗壞血酸含量高于214.68μg·g^-1、丙二醛低于0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基含量低于146.98 nmol·g^-1·min^-1；

同時滿足1）、2）指標體系及閾值范圍，則為抗旱苜蓿品種。

作為優選，步驟（1）中所述苜蓿幼苗培養是將供試苜蓿種子播種在營養缽內，出苗后間苗，生長期間澆灌Hoagland營養液。

本發明采用2個極高濃度的PEG-6000溶液模擬強干旱脅迫環境結合測定苜蓿對抗旱性貢獻較大的生理指標，通過比較不同抗旱苜蓿品種對高濃度PEG脅迫的耐受能力及相應的敏感性生理指標變化閾值，準確、高效地篩選抗旱苜蓿品種。

本發明方法采用2個極高濃度的PEG-6000脅迫結合測定對苜?？购敌苑磻蠲舾械纳碇笜?，確定出不同濃度PEG脅迫下，反映抗旱能力苜蓿品種的敏感性生理指標體系及相應的生理指標敏感閾值，可進一步簡單、準確地從苜蓿種質中篩選出抗旱苜蓿品種，也可為進一步挖掘和利用較強抗旱苜蓿品種自身的抗逆基因提供參考方法，具有一定的實用性和可靠性。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

實施例1

一種高效篩選抗旱苜蓿品種的方法，步驟如下：

（1）苜蓿幼苗培養。可以采用現有技術中任何苜蓿幼苗培養方法進行培養，比如采用營養液沙培法。將供試苜蓿種子播種在營養缽內，出苗后間苗，生長期間澆灌Hoagland營養液；

（2）用含0.38 g/mL(-1.6 MPa)和0.43g/mL (-2.0 MPa)PEG-6000溶液的Hoagland營養液模擬干旱脅迫，對生長6周左右的苜蓿幼苗根際脅迫處理7d；

（3）分別測定2個PEG-6000濃度脅迫下，苜蓿的下列生理指標；

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，測定羥自由基（OH^?）濃度和過氧化氫酶（CAT）活性；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時，測定可溶性糖含量、葉綠素含量、POD活性、葉片相對含水量（RWC）、還原性抗壞血酸（AsA）含量、丙二醛（MDA）和超氧陰離子自由基（O₂^?-）；

（4）根據不同濃度的PEG-6000溶液脅迫下各生理指標的敏感閾值，篩選抗旱苜蓿品種：

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，若苜蓿體內羥自由基（OH^?）濃度低于4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性高于251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時，若苜蓿體內的可溶性糖含量高于20.94 mg·g^-1、Chl b高于1.51 mg·g^-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g^-1、POD活性高于584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對含水量（RWC）高于29.45%、還原性抗壞血酸（AsA）含量高于214.68μg·g^-1、丙二醛（MDA）低于0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基（O₂^?-）含量低于146.98 nmol·g^-1·min^-1；

同時滿足1）、2）指標體系及閾值范圍，則為抗旱苜蓿品種。

實施例2

本實驗以長期生長于年降雨量200~350mm，年蒸發量1531mm，年平均氣溫 6.3℃，年日照時數 2500 h，無霜期平均為 140 d的黃土高原隴中干旱區域的強抗旱苜蓿品種隴中苜蓿為例，采用PEG-6000模擬干旱脅迫，測定其響應干旱脅迫時反應較敏感的生理指標，步驟如下：

（1）隴中苜蓿幼苗培養。采用營養液沙培法。將供試苜蓿種子播種在營養缽內，出苗后間苗，生長期間澆灌Hoagland營養液；

（2）用含0.38 g/mL(-1.6 MPa)和0.43g/mL (-2.0 MPa)PEG-6000溶液的Hoagland營養液模擬干旱脅迫，對生長6周左右的苜蓿幼苗根際脅迫處理7d；

（3）分別測定2個PEG-6000濃度脅迫下，反映隴中苜蓿抗旱性的生理指標，包括：葉綠素a(Chl a)、葉綠素b( Chl b) 、葉綠素(a+b)、葉片相對含水量（RWC）、脯氨酸含量（Pro）、可溶性蛋白含量（SP）、可溶性糖含量（SS）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H₂O₂）含量、羥自由基含量（OH^·）、 超氧陰離子自由基（O₂^·-）、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、還原性抗壞血酸（AsA）含量、還原性抗壞血酸（GSH）含量。

（4） 主成分分析法分析隴中苜蓿響應干旱脅迫時反應最敏感的生理指標。

1） 0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，隴中苜蓿前2個主成分的貢獻率分別為68.38%和31.62%，累積方差貢獻率為100%，表明前2個主成分可將隴中苜蓿100%的抗旱性信息反映出來。第一主成分對應較大的特征向量有Chl b、RWC、OH^? 和Chl (a+ b)；第二主成分對應較大的特征向量有 CAT；

2）0.43 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，隴中苜蓿前2個主成分的貢獻率分別為60.12%和39.88%，累積方差貢獻率為100%，表明前2個主成分可將隴中苜蓿100%的抗旱性信息反映出來。第一主成分對應較大的特征向量有SS、Chl b、Chl( a+b)和POD；第二主成分對應較大的特征向量有 RWC、MDA、O₂^?-和AsA。

（5）確定隴中苜蓿響應干旱脅迫時反應最敏感的生理指標的含量。

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，隴中苜蓿體內羥自由基（OH^?）濃度為4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性為251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時，苜蓿體內的可溶性糖含量為20.94 mg·g^-1、Chl b為1.51 mg·g^-1、Chl(a+b)為2.45 mg·g^-1、POD活性為584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對含水量（RWC）為29.45%、還原性抗壞血酸（AsA）含量為214.68μg·g^-1、丙二醛（MDA）為0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基（O₂^?-）含量為146.98 nmol·g^-1·min^-1。

（6）不同PEG濃度脅迫下篩選抗旱苜蓿品種的生理指標體系及相應的閾值范圍。

1）0.38 g/mL PEG-6000溶液脅迫時，苜蓿體內羥自由基（OH^?）濃度低于4143.99 A·1000·g^-1，CAT活性高于251.46 U·g^-1·min^-1；

2）0.43g/mL PEG-6000溶液脅迫時，苜蓿體內的可溶性糖含量高于20.94 mg·g^-1、Chl b高于1.51 mg·g^-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g^-1、POD活性高于584.32 U·g^-1·min^-1、葉片相對含水量（RWC）高于29.45%、還原性抗壞血酸（AsA）含量高于214.68μg·g^-1、丙二醛（MDA）低于0.14μmol·g^-1、超氧陰離子自由基（O₂^?-）含量低于146.98 nmol·g^-1·min^-1；

隴中苜蓿同時滿足1）、2）指標體系及閾值范圍，為抗旱苜蓿品種。

最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。