本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種微斑報春苣苔的無菌播種和組織培養方法。
背景技術：
微斑報春苣苔(Primulina minutimaculata)為苦苣苔科報春苣苔屬的多年生草本植物。分布于廣西龍州、天等，生于石山林下石上，海拔200-450m，花期4-5月。微斑報春苣苔在龍州和天等的分布范圍雖然較廣，但分布零星，且居群小，植株個體數量較少，自身更新困難。此外，由于開山筑路等對生境嚴重破壞，導致居群迅速退縮，目前已處于瀕危狀態，IUCN等級為極危。
微斑報春苣苔花型獨特，葉片具有魅力的斑紋，觀賞價值極高，受到國外眾多觀賞植物愛好者和育種者的廣泛關注，是極具開發利用的喀斯特野生花卉。傳統的繁殖以種子播種和葉片扦插為主，但繁殖速度慢，繁殖系數小。而組織培養能夠在短時間內獲得大量遺傳性狀一致的優質苗，克服了常規繁殖周期長、繁殖系數小的缺點。
目前，組織培養在報春苣苔屬的其他植物上得到了廣泛應用，且多以葉片為外植體，而在微斑報春苣苔上的應用尚未有報道。因此，通過微斑報春苣苔的種子無菌萌發進而進行分化培養、增殖培養、生根培養、煉苗移栽，從而建立微斑報春苣苔的組織培養體系，對其規模化生產和種質資源收集及保存具有積極意義。
技術實現要素：
針對現有的微斑報春苣苔人工繁育技術的匱乏與不足，本發明提供一種微斑報春苣苔的無菌播種和組織培養方法，該方法具有種子萌發率高、成苗快、種苗品質好等特點，能在短期內獲得大量的組培苗，是微斑報春苣苔種苗生產及資源保護的有效途徑。
為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：
一種微斑報春苣苔的無菌播種和組織培養方法，包括如下步驟：
(1)種子的無菌萌發：取成熟未開裂的微斑報春苣苔的果莢，用洗潔精浸洗10-15min后在流水下沖洗干凈10-15min，在超凈工作臺上先用75％酒精中浸泡果莢30-40s，無菌水沖洗3-5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果莢12-15min，無菌水沖洗3-5次，在接種盤上切開果莢，并用經過消毒滅菌的勺子輕輕將種子撥入種子萌發培養基中，播種好的種子先在光照培養箱中暗培養至種子萌發，然后再轉入培養室中光培養；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；
(2)初代培養：將已經萌發子葉但尚未長出真葉的小苗切成子葉、胚軸兩部分，然后接入不同的初代培養基中；子葉28-32d可直接誘導出不定芽，并且在子葉基部有愈傷組織產生；胚軸30d能誘導愈傷組織；
(3)不定芽的增殖培養：將具有1對以上葉片的不定芽切取下來，接入增殖培養基中培養26-28d；
(4)愈傷組織的分化培養：將愈傷組織切成1cm×1cm的小塊接入分化培養基中培養29-30d；
(5)生根培養：當組培芽具有2對以上葉片時，轉接于生根培養基中培養23-25d；
(6)煉苗移栽：將具有2-3對葉片的生根苗移出培養室，在溫室中煉苗10-14d；洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中，澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為40-50％，移栽7d后，用1/2MS營養液澆淋，連續淋2次，時間間隔為7d，移栽后20d后統計成活率。
作為優選，步驟(1)中所述的暗培養的溫度為17-20℃；所述的光培養溫度23-25℃，光照為1000-1400lx。
作為優選，步驟(1)中所述的萌發培養基以MS+GA31.0-2.0mg/L+活性炭0.5g/L。
作為優選，步驟(2)中用于子葉的不定芽誘導培養基為MS+KT 1.0-2.0mg/L+NAA 0.01-0.1mg/L，愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU 0.1-1.0mg/L+2,4-D 1.5-2.0mg/L；用于胚軸的愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU0.1-1.0mg/L+2,4-D1.5-2.0mg/L。
作為優選，步驟(3)中所述的增殖培養基以MS+6-BA1.0-3.0mg/L+IBA0.1-0.30mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L。
作為優選，步驟(4)中所述的分化培養基為MS+ZT0.1-1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L。
作為優選，步驟(5)中所述的生根培養基為1/2MS+IBA1.0-3.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L。
作為優選，所述1/2MS培養基為：將MS培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/L，其余成分及用量與MS保持一致。
作為優選，步驟(6)中所述的基質由泥炭和粗沙按照體積比為2:1組成。
作為優選，步驟(6)中所述的1/2MS營養液為MS培養基中的大量元素減半，其余成分及用量與MS保持一致，不添加蔗糖和瓊脂。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明的微斑報春苣苔的組織培養方法具有種子萌發率高、成苗快、種苗品質好等特點，能在短期內獲得大量的組培苗，是微斑報春苣苔種苗生產及資源保護的有效途徑。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和本質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
實施例1：
一種微斑報春苣苔的無菌播種和組織培養方法，包括如下步驟：
(1)種子的無菌萌發：取成熟未開裂的微斑報春苣苔的果莢，用洗潔精浸洗10min后在流水下沖洗干凈10min，在超凈工作臺上先用75％酒精中浸泡果莢30s，無菌水沖洗3次，再用0.1％升汞溶液浸泡果莢12min，無菌水沖洗3次，在接種盤上切開果莢，并用經過消毒滅菌的勺子輕輕將種子撥入種子萌發培養基中，播種好的種子先在光照培養箱中暗培養至種子萌發，然后再轉入培養室中光培養；所述的暗培養的溫度為17℃；所述的光培養溫度23℃，光照為1000lx；所述的萌發培養基以MS+GA3 1.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；
(2)初代培養：將已經萌發子葉尚未長出真葉的小苗切成子葉、胚軸兩部分，然后接入不同的初代培養基中；子葉28d可直接誘導出不定芽，并且在子葉基部有愈傷組織產生；胚軸30d能誘導愈傷組織；用于子葉的不定芽誘導培養基為MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L，愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU 0.1mg/L+2,4-D 1.5mg/L；用于胚軸的愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU 0.1mg/L+2,4-D 1.5mg/L；
(3)不定芽的增殖培養：將具有1對以上葉片的不定芽切取下來，接入增殖培養基中培養26d；所述的增殖培養基以MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L；
(4)愈傷組織的分化培養：將愈傷組織切成1cm×1cm的小塊接入分化培養基中培養29d；所述的分化培養基為MS+ZT 0.1mg/L+IBA 0.1mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L；
(5)生根培養：當組培芽具有2對以上葉片時，轉接于生根培養基中培養23d；所述的最佳生根培養基為1/2MS+IBA 1.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L；所述1/2MS培養基為：將MS培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/L，其余成分及用量與MS保持一致；
(6)煉苗移栽：將具有2對葉片的生根苗移出培養室，在溫室中煉苗10d；洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中，澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為40％，移栽7d后，用1/2MS營養液澆淋，連續淋2次，時間間隔為7d，移栽后20d后統計成活率；所述的基質由泥炭和粗沙按照體積比為2:1組成；所述的1/2MS營養液為MS培養基中的大量元素減半，其余成分及用量與MS保持一致，不添加蔗糖和瓊脂。
實施例2：
一種微斑報春苣苔的無菌播種和組織培養方法，包括如下步驟：
(1)種子的無菌萌發：取成熟未開裂的微斑報春苣苔的果莢，用洗潔精浸洗15min后在流水下沖洗干凈15min，在超凈工作臺上先用75％酒精中浸泡果莢40s，無菌水沖洗5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果莢15min，無菌水沖洗5次，在接種盤上切開果莢，并用經過消毒滅菌的勺子輕輕將種子撥入種子萌發培養基中，播種好的種子先在光照培養箱中暗培養至種子萌發，然后再轉入培養室中光培養；所述的暗培養的溫度為20℃；所述的光培養溫度25℃，光照為1400lx；所述的萌發培養基以MS+GA3 2.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；
(2)初代培養：將已經萌發子葉尚未長出真葉的小苗切成子葉、胚軸兩部分，然后接入不同的初代培養基中；子葉32d可直接誘導出不定芽，并且在子葉基部有愈傷組織產生；胚軸30d能誘導愈傷組織；用于子葉的不定芽誘導培養基為MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L，愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU 1.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L；用于胚軸的愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU1.0mg/L+2,4-D2.0mg/L；
(3)不定芽的增殖培養：將具有1對以上葉片的不定芽切取下來，接入增殖培養基中培養28d；所述的增殖培養基以MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.30mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L；
(4)愈傷組織的分化培養：將愈傷組織切成1cm×1cm的小塊接入分化培養基中培養30d；所述的分化培養基為MS+ZT1.0mg/L+IBA0.3mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L；
(5)生根培養：當組培芽具有2對以上葉片時，轉接于生根培養基中培養25d；所述的最佳生根培養基為1/2MS+IBA3.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L；所述1/2MS培養基為：將MS培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/L，其余成分及用量與MS保持一致；
(6)煉苗移栽：將具有3對葉片的生根苗移出培養室，在溫室中煉苗14d；洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中，澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為50％，移栽7d后，用1/2MS營養液澆淋，連續淋2次，時間間隔為7d，移栽后20d后統計成活率；所述的基質由泥炭和粗沙按照體積比為2:1組成；所述的1/2MS營養液為MS培養基中的大量元素減半，其余成分及用量與MS保持一致，不添加蔗糖和瓊脂。。
實施例3：
一種微斑報春苣苔的無菌播種和組織培養方法，包括如下步驟：
(1)種子的無菌萌發：取成熟未開裂的微斑報春苣苔的果莢，用洗潔精浸洗13min后在流水下沖洗干凈13min，在超凈工作臺上先用75％酒精中浸泡果莢35s，無菌水沖洗3-5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果莢14min，無菌水沖洗4次，在接種盤上切開果莢，并用經過消毒滅菌的勺子輕輕將種子撥入種子萌發培養基中，播種好的種子先在光照培養箱中暗培養至種子萌發，然后再轉入培養室中光培養；所述的暗培養的溫度為18℃；所述的光培養溫度24℃，光照為1200lx；所述的萌發培養基以MS+GA3 1.5mg/L+活性炭0.5g/L；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐溫-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐溫-20；
(2)初代培養：將已經萌發子葉尚未長出真葉的小苗切成子葉、胚軸兩部分，然后接入不同的初代培養基中；子葉30d可直接誘導出不定芽，并且在子葉基部有愈傷組織產生；胚軸30d能誘導愈傷組織；用于子葉的不定芽誘導培養基為MS+KT 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L，愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU 0.6mg/L+2,4-D 1.8mg/L；用于胚軸的愈傷組織誘導培養基為MS+CPPU 0.3mg/L+2,4-D 1.8mg/L；
(3)不定芽的增殖培養：將具有1對以上葉片的不定芽切取下來，接入增殖培養基中培養27d；所述的增殖培養基以MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L；
(4)愈傷組織的分化培養：將愈傷組織切成1cm×1cm的小塊接入分化培養基中培養29-30d；所述的分化培養基為MS+ZT 0.4mg/L+IBA 0.2mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋果20g/L+椰汁100ml/L；
(5)生根培養：當組培芽具有2對以上葉片時，轉接于生根培養基中培養24d；所述的最佳生根培養基為1/2MS+IBA 2.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L；所述1/2MS培養基為：將MS培養基中的大量元素減至一半，蔗糖為15g/L，其余成分及用量與MS保持一致；
(6)煉苗移栽：將具有2對葉片的生根苗移出培養室，在溫室中煉苗12d；洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中，澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為45％，移栽7d后，用1/2MS營養液澆淋，連續淋2次，時間間隔為7d，移栽后20d后統計成活率；所述的基質由泥炭和粗沙按照體積比為2:1組成；所述的1/2MS營養液為MS培養基中的大量元素減半，其余成分及用量與MS保持一致，不添加蔗糖和瓊脂。。
將上述實施例1-3得到的微斑報春苣苔的組織培養方法中種子萌發率、不定芽誘導、愈傷組織誘導、增殖培養、分化培養、生根情況以及組培苗的移栽成活率進行調查統計，結果見表1。
表1本發明的微斑報春苣苔的組織培養方法對種子萌發、不定芽誘導、愈傷組織誘導、不定芽的增殖、愈傷組織的分化以及生根情況的測定
由表1可知，本發明的微斑報春苣苔的組織培養方法得到的不定芽長勢良好，不定芽多；其生根率為100％，組培苗的移栽成活率為100％。可見，本發明的方法具有明顯的技術優勢，值得進一步推廣和應用。
前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。